وزارت علوم، تحقيقات و فناوري
پژوهشگاه ملي مهندسي ژنتيک و زيستفناوري
پژوهشکده زيستفناوري پزشکي
پاياننامه كارشناسي‌ ارشد
در رشته زيستشناسي سلولي- مولکولي
عنوان:
تاثير کاهش حجم مايع بلاستوسل قبل از انجماد شيشهاي بر بيان ژنهاي
اختصاصي اندودرم اوليه رويان موش
پژوهشگر:
پريناز کاظمي
اساتيد راهنما:
دکتر مجتبي دشتيزاد
دکتر قاسم آهنگري
استاد مشاور:
دکتر مهدي شمسآرا
اسفند ماه سال 1393
تقدير و تشکر
سپاس خداي را که سخنوران، در ستودن او بمانند و شمارندگان، شمردن نعمتهاي او ندانند و کوشندگان، حق او را گزاردن نتوانند. آفريدگاري که خويشتن را به ما شناساند و درهاي علم را بر ما گشود و عمري و فرصتي عطا فرمود تا بدان بنده ضعيف خويش را در طريق علم و معرفت بيازمايد.
نهال را باران بايد تا سيرابش کند از آب حيات و آفتاب بايد تا بتاباند نيرو را و محکم کند شاخههاي تازه روييده را؛ بسي شايسته است از اساتيد فرهيخته و بزرگوارم جناب آقاي دکتر دشتيزاد که با هدايت و حمايتهاي بيدريغشان ياريام نمودند و برايم زندگي کردن و انسان بودن را معنا کردند و جناب آقاي دکتر مهدي شمسآرا که همواره آسمان صبر و دشت علمشان فرا راه تلاشم بوده است، تقدير و تشکر نمايم.
همچنين از جناب آقاي دکتر آهنگري کمال تشکر و قدرداني را دارم و از خداوند منان سلامت و سعادت ايشان را خواستارم.
سپاس آخر را به دوست و همکار عزيزم، سرکار خانم فروغ مهدوينژاد، که صادقانه و صميمانه مرا در انجام اين پروژه ياري نمود تقديم مينمايم.
باشد که اين، خردترين بخشي از زحمات آنان را سپاس گويد.
ما حصل آموختههايم را ضمن تشکر و سپاس بيکران تقديم ميکنم به
خانوادهي عزيزم، آنان که مهر آسمانيشان آرام بخش آلام زمينيام است. هرچه آموختم در مکتب عشق آنان آموختم و هرچه بکوشم قطرهاي از درياي بيکران مهربانيشان را سپاس نتوان بگويم.
چکيده فارسي
مطالعات انجام شده در سالهاي اخير نشان ميدهند که سوراخ کردن مصنوعي بلاستوسيست قبل از انجماد شيشهاي، در بهبود کيفيت رويانهاي ذوب شده موثر است. اما در اين مطالعات، به نقش آب درون حفره و تاثير آن بر روي تشکيل ردههاي سلولي بلاستوسيست، توجه نشده است. بنابراين در تحقيق حاضر، علاوه بر ارزيابي نرخ زندهماني و خروج از زونا، اثر کاهش مايع بلاستوسل قبل از انجماد شيشهاي، بر روي ميزان بيان ژنهاي Gata6 و Grb2 در بلاستوسيست درونتني و برونتني منجمد-ذوب شده و سوراخ شده قبل از انجماد بررسي شد و با گروه کنترل مقايسه گرديد. در اين مطالعه، ميزان خروج از زونا با سوراخ کردن مصنوعي بلاستوسيست قبل از انجماد، بهصورت معنيداري افزايش يافت. اين در حالي است که ميزان زندهماني در گروههاي تحت تيمار، مشابه با گروه کنترل، بالا بود. انجماد شيشهاي موجب افزايش در ميزان بيان ژنهاي Gata6 و Grb2 شد (p<0.05). اما با کاهش مايع بلاستوسل قبل از انجماد، در بلاستوسيستهاي درونتني، ميزان بيان اين ژنها نسبت به گروه انجماد شيشهاي بهصورت معنيداري کاهش پيدا کرد و به گروه کنترل نزديک شد (p<0.05). در حالي که در مورد بلاستوسيستهاي برونتني، با استفاده از اين تکنيک، بيان ژن Grb2 افزايش پيدا کرد ولي تفاوت معنيداري در ميزان بيان ژن Gata6 نسبت به گروه انجماد شيشهاي ايجاد نشد. از آنجايي که هيچ نتيجهاي مبني بر تاثير منفي استفاده از اين تکنيک مشاهده نگرديد و با توجه به افزايش ميزان خروج از زونا، کاهش حجم مايع بلاستوسل قبل از انجماد شيشهاي ميتواند مفيد واقع شود.
کلمات کليدي: لقاح آزمايشگاهي، انجماد شيشهاي، سوراخ کردن مصنوعي، بيان ژن، Real Time PCR
فهرست مطالب
1 مقدمه و مروري بر مطالعات انجام شده…………………………………………………………..2
1-1 تکوين پيش از لانهگزيني در موش…………………………………………………3
1-1-1 لقاح3
1-1-2 تکوين اوليه5
1-1-3 مکانيسمهاي مولکولي دخيل در لايهزايي رويان9
1-1-3-1 جدايي دو ردهي سلولي تروفواکتودرم و توده سلولي داخلي10
1-1-3-2 جدايي دو ردهي سلولي اپيبلاست و اندودرم اوليه11
1-2 تکنيکهاي کمک باروري…………………………………………………………13
1-2-1 لقاح آزمايشگاهي13
1-2-1-1 کيفيت سلول تخم14
1-2-2 کشت آزمايشگاهي رويان15
1-2-3 انجماد16
1-2-3-1 اصول انجماد17
1-2-3-2 مواد سرما محافظ18
1-2-3-3 روشهاي انجماد19
1-2-3-3-1 انجماد آهسته20
1-2-3-3-2 انجماد شيشهاي21
1-2-4 سوراخ کردن مصنوعي22
2 مواد و روشها…………………………………………………………………………………….25
2-1 حيوان…………………………………………………………………………..25
2-2 توليد رويان آزمايشگاهي…………………………………………………………………26
2-2-1 استحصال اسپرم26
2-2-1-1 آمادهسازي محيط و قطرهها26
2-2-1-2 جابجايي مهرهي گردني27
2-2-1-3 تشريح موش نر و جداسازي اپيديديم28
2-2-1-4 جمعآوري و ظرفيتپذيري اسپرم29
2-2-2 استحصال تخمک31
2-2-2-1 تحريک تخمکگذاري31
2-2-2-1-1 تزريق داخل صفاقي31
2-2-2-2 آمادهسازي محيط و قطرهها32
2-2-2-3 جابجايي مهرهي گردني32
2-2-2-4 تشريح موش ماده و جداسازي لولهي تخمبر32
2-2-2-5 جداسازي تودهي تخمک-کومولوس33
2-2-3 لقاح آزمايشگاهي34
2-2-3-1 آمادهسازي محيط و قطرهها34
2-2-3-2 لقاح35
2-2-4 کشت آزمايشگاهي35
2-2-4-1 آمادهسازي محيط و قطرهها35
2-2-4-2 کشت رويان36
2-3 توليد رويان درونتني…………………………………………………………….37
2-3-1 تحريک تخمکگذاري و جفت اندازي موشها37
2-3-2 آمادهسازي محيط و قطرهها37
2-3-3 جابجايي مهرهي گردني37
2-3-4 تشريح موش ماده و جداسازي لولههاي رحمي37
2-3-5 استحصال بلاستوسيست38
2-4 سوراخ کردن مصنوعي بلاستوسيست………………………………………………39
2-4-1 آمادهسازي محيط و قطرهها39
2-4-2 آمادهسازي و تنظيم دستگاه ريزدستکاري40
2-4-3 روش کار40
2-5 انجماد رويان……………………………………………………………………41
2-5-1 انجماد شيشهاي41
2-5-1-1 آمادهسازي محيط و قطرهها41
2-5-1-2روش کار42
2-5-2يخگشايي43
2-5-2-1 آمادهسازي محيط و قطرات43
2-5-2-2روش کار44
2-6 بررسي بيان ژن………………………………………………………………………………………..45
2-6-1 استخراج RNA از بلاستوسيست45
2-6-2 ساخت cDNA46
2-6-3 طراحي پرايمر47
2-6-4 رقيقسازي پرايمرها47
2-6-5 واکنش زنجيرهاي پليمراز48
2-6-6 ژل الکتروفورز محصولات PCR49
2-6-7 واکنش زنجيرهاي پليمراز در زمان واقعي49
2-7 طراحي آزمايش…………………………………………………………………52
2-7-1 کاهش مايع بلاستوسل رويانهاي درونتني موش، قبل از انجماد شيشهاي………….52
2-7-2 کاهش مايع بلاستوسل رويانهاي برونتني موش، قبل از انجماد شيشهاي…………..52
2-7-3 آناليز آماري52
3 نتايج………………………………………………………………………………………………………………54
3-1 کاهش مايع بلاستوسل رويانهاي درونتني موش قبل از انجماد شيشهاي……………54
3-1-1 نرخ زندهماني و خروج از زونا54
3-1-2 بيان نسبي ژنهاي Gata6 و Grb256
3-1-2-1 واکنش زنجيرهاي پليمراز56
3-1-2-2 واکنش زنجيرهاي پليمراز در زمان واقعي57
3-2 کاهش مايع بلاستوسل رويانهاي برونتني موش قبل از انجماد شيشهاي……………62
3-2-1 نرخ زندهماني و خروج از زونا62
3-2-2 بيان نسبي ژنهاي Gata6 و Grb264
4 بحث و نتيجهگيري………………………………………………………………………67
5 فهرست منابع…………………………………………………………………………..76
6 پيوستها………………………………………………………………………………83
فهرست جداول
جدول ‏1-1: ترکيبات محيط HTF14
جدول ‏1-2: ترکيبات محيط KSOM16
جدول ‏2-1: محلولهاي مورد نياز براي انجماد شيشهاي بلاستوسيست موش42
جدول ‏2-2: محلولهاي مورد نياز براي يخگشايي بلاستوسيست موش44
جدول ‏2-3: مواد مورد استفاده جهت ساخت cDNA46
جدول ‏2-4: چرخههاي حرارتي ساخت cDNA46
جدول ‏2-5: مشخصات پرايمرهاي طراحي شده47
جدول ‏2-6: مواد مورد نياز جهت انجام واکنش زنجيرهاي پليمراز48
جدول ‏2-7: چرخههاي حرارتي مراحلPCR 48
جدول ‏2-8: مواد مورد نياز جهت انجام Real Time PCR50
جدول ‏2-9: چرخههاي حرارتي Real Time PCR50
جدول ‏3-1: ميزان زندهماني و ميزان خروج از زوناي بلاستوسيست درونتني موش55
جدول ‏3-2: ميزان زندهماني و ميزان خروج از زوناي بلاستوسيست برونتني موش.63
فهرست اشکال
شکل ‏1-1: مراحل مختلف تکوين پيش از لانهگزيني در موش2
شکل ‏1-2: بخشهاي مختلف لولهي تخمبر3
شکل ‏1-3: فرايند گامتزايي4
شکل ‏1-4: اسپرم و تخمک پستانداران5
شکل ‏1-5: قطبيت رويان موش.6
شکل ‏1-6: تقسيم مرحلهي 8 به 16 سلولي7
شکل ‏1-7: تشکيل حفرهي بلاستوسل.7
شکل ‏1-8: آرايش سيستمهاي انتقالي در سلولهاي تروفواکتودرم8
شکل ‏1-9: بلاستوسيست در حال خروج از زونا9
شکل ‏1-10: مسير تمايز رده تروفواکتودرم در موش.10
شکل ‏1-11: جدايي دو رده سلولي اندودرم اوليه و اپيبلاست در سه مرحله11
شکل ‏1-12: دخالت مسير پيامرسان FGF/MAPK 13
شکل ‏1-13: فرايند شيشهاي شدن محيط انجماد.21
شکل ‏1-14: روشهاي مختلف سوراخ کردن مصنوعي حفرهي بلاستوسل.24
شکل ‏2-1: قفسهاي داراي سيستم تهويهي مجزا26
شکل ‏2-2: پتري ديش استحصال اسپرم27
شکل ‏2-3: جابجايي مهرههاي گردني28
شکل ‏2-4: تشريح موش نر 29
شکل ‏2-5: جمعآوري اسپرم30
شکل ‏2-6: نحوهي جمعآوري اسپرمهاي زنده از حاشيهي قطرهي محيط کشت30
شکل ‏2-7: نحوهي ترزيق داخل صفاقي موش31
شکل ‏2-8: پتري ديش استحصال تخمک32
شکل ‏2-9: جداسازي لولهي تخمبر33
شکل ‏2-10: جداسازي تودهي تخمک-کومولوس34
شکل ‏2-11: پتري ديش IVF34
شکل ‏2-12: تخمک-کومولوسهاي مجزا35
شکل ‏2-13: نحوهي قطرهگذاري محيط KSOM در پليت کشت رويان36
شکل ‏2-14: جداسازي لولههاي رحمي.38
شکل ‏2-15: استحصال بلاستوسيست از لولهي رحمي39
شکل ‏2-16: پتري ديش ريز دستکاري40
شکل ‏2-17: نحوهي سوراخ کردن حفرهي بلاستوسيست41
شکل ‏2-18: نحوهي قطرهگذاري محلولهاي انجماد شيشهاي42
شکل ‏2-19: موقعيت قرار گيري بلاستوسيست بر روي کرايوتاپ 43
شکل ‏2-20: پتري ديش حاوي محلول يخگشايي44
شکل ‏3-1: بلاستوسيستهاي درونتني موش بعد از انجماد-ذوب در محيط KSOM..56
شکل ‏3-2: الکتروفورز محصولات PCR بر روي ژل آگارز.57
شکل ‏3-3: منحني استاندارد ژنهاي Grb2، Gata6 و B2m 58
شکل ‏3-4: منحني تکثير ژنهاي Grb2، Gata6 و B2m59
شکل ‏3-5: منحنيهاي ذوب مربوط به ژنهاي Grb2، Gata6، B2m.60
شکل ‏3-6: اثر تيمارهاي مورد آزمايش بر روي بيان نسبي ژن Gata661
شکل ‏3-7: اثر تيمارهاي مورد آزمايش بر روي بيان نسبي ژن Grb262
شکل ‏3-8: مراحل مختلف رشد و تکوين رويان موش پيش از لانهگزيني63
شکل ‏3-9: اثر تيمارهاي مورد آزمايش بر روي بيان نسبي ژن Gata664
شکل ‏3-10: اثر تيمارهاي مورد آزمايش بر روي بيان نسبي ژن Grb2 65
ليست اختصاراتوزن مولکوليMWمولارMميليمولارmMپيکومولPmليترLميليليترMlميکروليترµlکيلوگرمkg گرمGميليگرمMgميکروگرمµgنانوگرمNgميکرومترµmنانومترNmواحد بينالملليIUنوکلئوتيدNtميلياسمولm.OsmثانيهSدرجه سليسيوس°Cجفت بازbp
1 مقدمه و مروري بر مطالعات انجام شده
تکوين قبل از لانهگزيني1، در همهي پستانداران با يک سلول منفرد به نام تخم2 آغاز ميشود و با ايجاد بلاستوسيست3 از طريق چندين تقسيم متوالي، پايان مييابد (Rossant and Tam, 2009). مطالعه در مورد رخدادهاي اين دوره، براي افزايش موفقيت در تکنيکهاي کمک باروري4 الزامي است. بيشتر اطلاعات ما دربارهي تکوين قبل از لانهگزيني، از مطالعه بر روي موش بدست آمده است. از مزاياي استفاده از موش ميتوان به تعداد نژادهاي بسيار زياد، تشابه ژنتيکي بالا با انسان، ارزان بودن گونهي موش نسبت به ساير گونهها، دوران بارداري کوتاه، تعداد زياد نوزادان در هر دورهي بارداري، سايز کوچک و نگهداري آسان اشاره کرد. بر همين اساس، استفاده از اين مدل آزمايشگاهي در تحقيقات مربوط به فرايندهاي توليدمثلي و تکنيکهاي کمک باروري رايج ميباشد.
شکل ‏1-1: مراحل مختلف تکوين پيش از لانهگزيني در موش (Oron and Ivanova, 2012).
1-1 تکوين پيش از لانهگزيني در موش
1-1-1 لقاح5
در پستانداران، ترکيب اسپرم و تخمک طي فرايند لقاح، منجر به تشکيل سلول تخم ميگردد. محل انجام اين فرايند، ناحيهي ابتدايي لوله تخمبر6 به نام آمپولا7 است (شکل ‏1-2) که دماي آن حدود 2 درجه سانتيگراد نسبت به ديگر نواحي لوله، گرمتر گزارش گرديده است (Daulat, 2012).
شکل ‏1-2: بخشهاي مختلف لولهي تخم بر(Ikawa et al., 2010).
سلولهاي جنسي شرکت کننده در لقاح، در بدن جاندار نر و ماده، طي فرايند گامتزايي8 ايجاد ميشوند (شکل ‏1-3). اسپرم توليد شده طي گامتزايي هنوز قابليت لقاح ندارد و براي حصول توانايي لازم براي بارورسازي تخمک، بايد تحت فرايندي قرار بگيرد که ظرفيتپذيري9 نام دارد. طي اين فرايند که با ورود اسپرم به بدن جاندار ماده انجام ميگيرد، تغييرات فيزيولوژي متنوعي درنواحي سر، آکروزوم10 و دم اين سلول جنسي رخ ميدهد (شکل ‏1-4).

شکل ‏1-3: فرايند گامتزايي که بهصورت اسپرمزايي در جنس نر (A) و تخمکزايي در جنس ماده (B) انجام ميپذيرد (Brevini and Pennarossa, 2013)
بعد از ظرفيتپذيري، قدم نهايي آمادهسازي اسپرم براي لقاح، واکنش آکروزومي11 است (شکل ‏1-4) که طي آن آنزيم و پروتئينهاي متنوعي از آکروزوم آزاد ميشود و به عبور اسپرم از توده سلولي متراکم12 و غشاي شفاف13 اطراف تخمک (شکل ‏1-4) کمک ميکند. فقط اسپرمهايي که از نظر واکنش آکروزومي فعال شدند، قدرت اتصال به تخمک را دارند (Okabe, 2013). پس از برقراري اين اتصال، غشاي پلاسمايي اسپرم و تخمک با يکديگر ترکيب ميگردند. با نفوذ اسپرم، تخمک فعال ميشود و با آزادسازي گرانولهاي قشري14 خود، از اتصال ساير اسپرمها به غشاي شفاف و در نتيجه ايجاد پلياسپرمي جلوگيري ميکند (Burkart et al., 2012). نتيجهي يک لقاح موفقيت آميز، ترکيب پيش هستههاي15 نر و ماده و تشکيل سلول تخم است.
شکل ‏1-4: اسپرم و تخمک پستانداران الف: تغييرات فيزيولوژيکي و مورفولوژيکي اسپرم به منظور آماده شدن براي لقاح، که در ابتدا ظرفيتپذيري و در ادامه واکنش آکروزومي را شامل ميشود ب: تخمک آزاد شده از تخمدان که با توده سلولي متراکم پوشيده شده و توسط غشاي شفاف از آن جدا گرديده است (Okabe, 2013).
1-1-2 تکوين اوليه
پس از لقاح، سلول تخم ايجاد شده، طي تقسيمات اوليهاي که تسهيم16 ناميده ميشوند، سلولهاي کوچکتري به نام بلاستومر17 ايجاد ميکند. يکي از وقايع مهمي که حين اين تقسيمات رخ ميدهد، فعال شدن ژنوم سلول تخم18 است که طي آن کنترل سلول از حالت مادري به حالت زيگوتي تغيير ميکند. به عبارت ديگر رونوشتهاي مادري تجزيه ميشوند و رونويسي از روي ژنوم سلول تخم آغاز ميگردد. در موش، اين تغيير در اواخر مرحلهي تک سلولي و مرحلهي دو سلولي رخ ميدهد (Cockburn and Rossant, 2010).
ادامهي اين تقسيمها، رويان19 را وارد مرحلهي چهار سلولي و سپس هشت سلولي ميکند. در اين مرحله، اتصالات بين سلولي20 افزايش پيدا ميکند. بلاستومرها از حالت کروي خارج ميشوند و رويان شکل فشردهتري به خود ميگيرد. اين فرايند که لازمهي رخدادهاي مورفولوژيکي بعدي است متراکم شدن21 نام دارد (شکل ‏1-1).
تا اين مرحله، بلاستومرها هيچگونه قطبيت22 داخل سلولي از خود نشان نميدادند اما با ورود به مرحلهي فشردگي و همزمان با افزايش اتصالات بين سلولي، همهي بلاستومرها، در راستاي محور عمود بر اتصالات سلولي، قطبي شده و دو ناحيهي راسي23 و پايهاي24 را شکل ميدهند (شکل ‏1-5) (Cockburn and Rossant, 2010).
شکل ‏1-5: قطبيت رويان موش. در مرحلهي 8 سلولي، همهي بلاستومرها قطبي شده و دو ناحيهي راسي و پايهاي را شکل ميدهند (Cockburn and Rossant, 2010).
اين دو ناحيه از نظر پراکنش اتصالات سلولي، پروتئينهاي قطبي، فاکتورهاي رونويسي و اسکلت سلولي متفاوت هستند. اين تفاوتها مقدمات ايجاد اولين ردههاي سلولي را، طي تقسيمهاي بعدي، فراهم ميکند. به اين صورت که، در مرحلهي 8 به 16 سلولي، اگر تقسيم متقارن انجام شود و صفحهي تقسيم، موازي با محور داخلي – خارجي باشد، دو سلول ايجاد شده مشابه با سلول مادري، قطبي بوده و در خارج قرار ميگيرند. اما اگر صفحهي تقسيم عمود بر اين محور باشد و تقسيم بهطور نامتقارن انجام گيرد، يک سلول قطبي و يک سلول غير قطبي ايجاد ميشود، که سلول قطبي در خارج و سلول غير قطبي در داخل قرار ميگيرد (شکل ‏1-6). مشابه اين تقسيمها، در مرحله 16 به 32 سلولي نيز رخ ميدهد. دو جمعيت سلولي ايجاد شده توسط اين تقسيمات، سرنوشت تکويني متفاوتي خواهند داشت (Oron and Ivanova, 2012). بلاستومرهاي قطبي که در قسمت خارجي رويان قرار گرفتهاند، ردهي تروفواکتودرم25 را شکل ميدهند و بلاستومرهاي غير قطبي، در ايجاد تودهي سلولي داخلي26 شرکت ميکنند (Xenopoulos et al., 2012).
شکل ‏1-6: تقسيم مرحلهي 8 به 16 سلولي. تقسيم متقارن دو سلول قطبي و تقسيم نا متقارن يک سلول قطبي و يک سلول غير قطبي ايجاد ميکند (Cockburn and Rossant, 2010).
با ورود به مرحلهي 32 سلولي و ايجاد ردهي تروفواکتودرم، حفرهي پر از مايعي به نام بلاستوسل27 شروع به شکلگيري ميکند. حضور حفرهي بلاستوسل، براي تکوين صحيح توده سلولي داخلي، ضروري است (شکل ‏1-7). تشکيل اين حفره، وابسته به عملکرد پمپ Na+/K+ است که در سمت پايهاي سلولهاي تروفواکتودرم قرار گرفته و با ايجاد شيب غلظت سديم، باعث ورود آب به درون رويان ميشود. در اين ميان، اتصالات محکم28 بين سلولهاي تروفواکتودرم، به حفظ حفره کمک ميکند و مانع جابجايي مايع بلاستوسل و يونهاي سديم، در دو طرف اين سلولها ميشود (Kidder and Watson, 2005, Cockburn and Rossant, 2010) (شکل ‏1-8).
شکل ‏1-7: تشکيل حفرهي بلاستوسل و رانده شدن توده سلولي داخلي به يک سمت از رويان (Xenopoulos et al., 2012).
شکل ‏1-8: آرايش سيستمهاي انتقالي29 در سلولهاي تروفواکتودرم که توسط اتصالات محکم و سوراخدار30 به يکديگر متصل شدهاند. پمپ Na+/K+ با همکاري کانالها و ناقلين يوني، موجب تجمع Na+ در سمت پايهاي سلولها ميشود. اين حالت، جريان يافتن آب به درون سلولهاي تروفواکتودرم و سپس به فضاي خارج سلولي سمت پايهاي را از طريق کانالهاي آبي آکوآپورين31 موجب ميشود (Kidder and Watson, 2005).
رويان 5/3 روزه که شامل حفرهي بلاستوسل و دو رده سلولي تروفواکتودرم و توده سلولي داخلي است، بلاستوسيست32 ناميده ميشود. در اين مرحله، توده سلولي داخلي که به دليل گسترش حفرهي بلاستوسل، به يک سمت رويان رانده شده، تمايز دو ردهي اپيبلاست33 و اندودرم اوليه34 را آغاز ميکند. سلولهاي متمايز شده به اندودرم اوليه در سطح توده سلولي، يعني جايي که با حفره در ارتباط است، قرار ميگيرند. در حالي که سلولهاي پرتوان اپيبلاست، بخش زيرين، يعني بين لايهي تروفواکتودرم و اندودرم اوليه را شامل ميشوند. پس از ايجاد اين سه رده در روز 5/4، بلاستوسيست کامل شده و آمادهي لانهگزيني در ديوارهي رحم ميگردد (Oron and Ivanova, 2012). تا اين مرحله، غشاي شفاف همچنان رويان را احاطه کرده و از آن حفاظت ميکند. اما قبل از لانهگزيني، براي اينکه رويان بتواند بهطور مستقيم با ديوارهي رحم ارتباط برقرار کند، بايد از اين غشا خارج شود. به اين فرايند خروج از زونا35 گفته ميشود که با نازک شدن غشا، به دليل رشد بلاستوسيست و ترشح برخي آنزيمها و در نهايت شکافته شدن آن همراه است (شکل ‏1-9) (Montag et al., 2000).
پس از لانهگزيني، هر کدام از اين ردههاي سلولي، مسير تکويني متفاوتي پيش خواهند گرفت. حضور رده ترفواکتودرم، براي لانهگزيني و الگوبندي رويان36 ضروري است. اين رده در نهايت جفت37 را تشکيل ميدهد. رده سلولي اندودرم اوليه، نقش مهمي در تکوين محور خلفي- قدامي دارد و نهايتا کيسه زرده38 را ميسازد. سلولهاي اپيبلاست نيز، رويان کامل را شکل ميدهند (شکل ‏1-9) (Oron and Ivanova, 2012, Yamanaka et al., 2006).
شکل ‏1-9: بلاستوسيست در حال خروج از زونا (1)، که شامل سه رده سلولي تروفواکتودرم (2)، اپيبلاست (3)، اندودرم اوليه (4) و همچنين حفرهي بلاستوسل (5) ميباشد (Lopata et al., 1983).
1-1-3 مکانيسمهاي مولکولي دخيل در لايهزايي رويان
يکي از ويژگيهاي منحصر به فرد تکوين پيش از لانهگزيني پستانداران، تنظيم بسيار دقيق وقايع آن است. اين ويژگي، در جدايي ردههاي سلولي، که تغييرات مورفولوژيکي با مکانيسمهاي مولکولي همراه شده، بسيار پررنگ است.
1-1-3-1 جدايي دو ردهي سلولي تروفواکتودرم و توده سلولي داخلي
طي تکوين ابتدايي رويان موش، اولين ردهي سلولي که ايجاد ميشود، تروفواکتودرم است که از تودهي سلولي داخلي متمايز ميگردد. جدا شدن اين دو ردهي سلولي، توسط گروه کوچکي از فاکتورهاي رونويسي کنترل ميشود. مطالعه بر روي رويان و سلولهاي بنيادي نشان داده است که ايجاد و حفظ ردهي سلولي تروفواکتودرم وابسته به عملکرد فاکتورهاي رونويسي مانندTead439، Cdx240 و 41Eomes است. از طرف ديگر، عوامل رونويسي همچون 42Oct4، Nanog و 43Sox2 وظيفهي حفظ پرتواني44 توده سلولي داخلي را دارند. ژنهاي پرتواني، توسط Cdx2 که پاييندست Tead4 قرار گرفته است، سرکوب ميشوند. از آنجايي که مسير پيامرسان Hippo، بيان اين فاکتور رونويسي را به سلولهاي خارجي (سلولهاي تروفواکتودرم آينده)، محدود ميکند (شکل ‏1-10)، فاکتورهاي پرتواني نيز، محدود به توده سلولي داخلي ميشوند. بنابراين، تمايز دو ردهي تروفواکتودرم و توده سلولي داخلي، از تفاوت بيان اين دو گروه ژن در بلاستومرهاي رويان، نشأت ميگيرد (Cockburn and Rossant, 2010, Strumpf et al., 2005).
شکل ‏1-10: مسير تمايز رده تروفواکتودرم در موش. اتصالات سلولي بلاستومرهاي داخلي، موجب راه اندازي مسير پيام رسان Hipoo، غيرفعال شدن Tead4 و بنابراين سرکوب Cdx2 ميشود. در سلولهاي خارجي، غيرفعال ماندن اين مسير، رونويسي از ژن Cdx2 را در پي دارد (Cockburn and Rossant, 2010).
1-1-3-2 جدايي دو ردهي سلولي اپيبلاست و اندودرم اوليه
جدايي اين دو ردهي سلولي، بيش از آنکه با موقعيت سلولها در ارتباط باشد، به بيان عوامل رونويسي وابسته است. بهطور کلي، وقايع اين دوره را ميتوان در سه مرحله خلاصه کرد (شکل ‏1-11). ابتدا، عوامل رونويسي اختصاصي دو رده، به شکل يکنواخت و همراه با هم در توده سلولي داخلي بيان ميشوند (پيرامون مرحلهي 32 سلولي). در ادامه، اين دو گروه عامل رونويسي، بصورت ناسازگار با هم و مستقل از موقعيت سلول، در تودهي داخلي توزيع ميگردند. به اين الگوي توزيع، اصطلاحا “نمک و فلفل45” گفته ميشود (پيرامون مرحلهي 64 سلولي). نهايتا، با حرکت سلولها به موقعيت مناسب خود، جدايي فضايي ومکاني دو رده نيز رخ ميدهد (پيرامون مرحلهي 100 سلولي) (Xenopoulos et al., 2012).
شکل ‏1-11: جدايي دو رده سلولي اندودرم اوليه و اپيبلاست در سه مرحله (Xenopoulos et al., 2012).
يکي از مسيرهاي انتقال پيام دخيل در اين ردهزايي، مسير FGF46/MAPK است که فعال شدن آن موجب القاي بيان عوامل رونويسي اختصاصي اندودرم اوليه، مانند 47Gata6 ميشود. Gata6 مانند 5 عضو ديگر خانوادهي GATA، داراي موتيف انگشت روي48 و همچنين قدرت اتصال به توالي (A/G) GATA (A/T) است.
گيرندهي اين مسير Fgfr2، ليگاند آن Fgf4 و پروتئين تطبيق دهندهي آن، Grb249 است. در مقابل، عوامل پرتواني قرار گرفتهاند که سلولهاي تودهي داخلي را به سمت اپيبلاست سوق ميدهند و موجب حفظ خاصيت پرتواني اين سلولها ميشوند. يکي از اين عوامل رونويسي Nanog است که در مرحلهي 64 سلولي، بيان آن با Gata6 ناسازگار ميشود. بنابراين سلولهايي که مسير انتقال پيام FGF/MAPK در آنها فعال باشد، با بيان Gata6 و مهار Nanog به سمت اندودرم اوليه متمايز ميشوند و بالعکس، سلولهايي با مسير انتقال پيام غيرفعال، ردهي اپيبلاست را تشکيل ميدهند (شکل ‏1-12). جهش در ژن Grb2 موجب اختلال در مسير FGF/MAPK و عدم شکلگيري اندودرم اوليه ميشود. اما در مورد رويانهايي که از نظر Gata6جهش يافتهاند، اندودرم اوليه شروع به شکلگيري ميکند ولي بعد از لانهگزيني، اندودرم احشايي50 ايجاد نميشود (Chazaud et al., 2006, Patient and McGhee, 2002).
قابل ذکر است که پس از مشخص شدن سرنوشت بلاستومرها توسط تنظيمات مولکولي، بازيابي مکاني اين دو گروه سلول، تحت اثر نوع اتصالات و همچنين پيامهايي که از طرف حفرهي بلاستوسل و سلولهاي تروفواکتودرم فرستاده ميشوند، انجام ميپذيرد. سلول پيشساز اندودرم اوليهاي که در عمق قرار گرفته است اگر موفق به جابجايي نشود، توسط مرگ برنامهريزي شده از بين ميرود و يا اينکه به سلول پرتوان اپيبلاست تبديل ميشود (Oron and Ivanova, 2012).
شکل ‏1-12: دخالت مسير پيام رسان FGF/MAPK در جدايي دو ردهي اندودرم اوليه و اپيبلاست. بازيابي مکاني اين دو رده در روز 5/4 کامل ميشود (Chazaud et al., 2006).
1-2 تکنيکهاي کمک باروري
يکي از ويژگيهاي رويان در مراحل قبل از لانهگزيني، توانايي تکوين آن در محيطهاي کشت ساخته شده توسط بشر است. اين انعطاف پذيري، در توسعه تکنيکهاي کمک باروري که امروزه به دليل افزايش ناباروري از اهميت قابل توجهي برخوردار هستند، کمک شاياني کرده است (Cockburn and Rossant, 2010).
1-2-1 لقاح آزمايشگاهي51
لقاح آزمايشگاهي، يکي از تکنيکهاي کمک باروري است، که به دلايل مختلفي همچون انسداد لولههاي رحم، تعداد کم اسپرم و چسبندگيهاي حفرهي لگني مورد استفاده قرار ميگيرد (Squires and Kaplan, 2007). تا کنون اين تکنيک، در بيش از 20 گونه از پستانداران صورت گرفته است. اولين بارداري موفق که منجر به تولد يک پستاندار زنده شد، توسط Chang در سال 1959 و بر روي خرگوش صورت پذيرفت (Chang, 1959). در سال 1968 نيز، براي نخستين بار رويانهاي موش حاصل از لقاح آزمايشگاهي متولد شدند (Whittingham, 1968). سرانجام اولين نوزاد انسان حاصل از IVF با همکاري Patrick Steptoe و Robert Edwards در 25 جولاي 1978 به دنيا آمد (Steptoe and Edwards, 1978).
به طور کلي، طي فرايند IVF، تخمک بالغ با اسپرم ظرفيتپذير شده، تحت شرايط خاص آزمايشگاهي از جمله ميزان کنترل شده O2، CO2، رطوبت و دما لقاح داده ميشوند. يک لقاح موفقيتآميز، تا حدودي وابسته به ترکيبات محيط مورد استفاده در اين فرايند است. اساس محيطهاي پرکاربرد در اين زمينه، محيطي به نام مايع لولهي رحمي انسان52 است که در سال 1985 به عنوان اولين محيط تخصصي لقاح آزمايشگاهي توسط Quinn فرمولبندي شد (جدول ‏1-1) (Quinn et al., 1985).
جدول ‏1-1: ترکيبات محيط HTF ساخته شده توسط Quinn (Quinn et al., 1985).
mMComponent101.6NaCl4.69KCl0.20MgSO4 . 7H2O0.37KH2PO42.04CaCl2 . 2H2O25NaHCO32.78Glucose0.33Na pyruvate21.4Na lactate100 U/mlPenicillin50 µg/mlStreptomycin SO40.001% (w/v)Phenol red
1-2-1-1 کيفيت سلول تخم
يکي از چالشهايي که در لقاح آزمايشگاهي وجود دارد، کاهش دادن تعداد رويانهاي انتقالي، بدون پايين آمدن شانس باروري است. اولين قدم در اين مسير، انتخاب سلولهاي تخم سالم و مناسب است. کيفيت سلول تخم را ميتوان از طريق بررسي تعداد، سايز و موقعيت پيش هستهها در آن، اجسام قطبي و کيفيت سيتوپلاسم ارزيابي کرد. يک تخمک لقاح يافتهي نرمال، داراي دو پيش هسته و دو جسم قطبي ميباشد. اما پيش هستهها همواره به راحتي قابل مشاهده نيستند. در اين صورت با مشاهدهي دو جسم قطبي، آن را سلول تخم در نظر ميگيريم. پيش هستههاي نر و ماده بسيار به يکديگر نزديک و معمولا همسايز يا با اختلاف خيلي جزئي تفاوت سايز دارند. سيتوپلاسم با کيفيت نيز، بدون واکوئل و يکنواخت ميباشد (Lundin et al., 2001, Balaban et al., 2004).
1-2-2 کشت آزمايشگاهي رويان53
کشت آزمايشگاهي سلولهاي تخم حاصل از لقاح خارج رحمي، راهکاري ديگر در راستاي افزايش نرخ باروري است. رشد سلول تخم، در محيط کشت و بررسي گذر آن از مراحل اوليهي تکوين، به انتخاب رويان مناسب، جهت انتقال به رحم کمک ميکند.
در اين رابطه، مرحلهي بلاستوسيست بسيار حائز اهميت است زيرا رويان در اين مرحله، داراي ژنوم فعال شده و پتانسيل تکويني بالاتري نسبت به مراحل قبلي از خود نشان ميدهد. بهعلاوه، با بررسي ويژگيهاي مورفولوژيکي آن، ميتوان موفقيت در لانهگزيني را تا حدودي پيشبيني و بنابراين رويان مناسبتري را جهت انتقال به رحم انتخاب کرد. به اين شکل بدون کاهش نرخ باروري ميتوان تعداد رويانهاي انتقالي را کاهش داد (Wittemer et al., 2000, Kova?i? and Vlaisavljevi?, 2012).
قابل ذکر است که ارزيابي مورفولوژيکي بلاستوسيستها، با بررسي نسبت حجم حفرهي بلاستوسل به کل رويان، حجم توده سلولي داخلي و انسجام سلولهاي ترفواکتودرم انجام ميپذيرد. در اين راستا معيارهاي ديگري مانند درجهي تکه تکه شدن54، ضخامت زونا، چند هستهاي بودن بلاستومرها و نسبت تعداد سلولهاي تودهي داخلي به کل سلولها نيز، مورد توجه قرار ميگيرد (Kova?i? and Vlaisavljevi?, 2012).
هرچند انعطاف پذيري بالاي رويان پستانداران، در مواجه با شرايط برونتني55 باعث زندهماني آنها در محيطهاي کشت شده است، اما هنوز نرخ زندهماني و کيفيت رويانها در اين حالت نسب به حالت درونتني56 پايينتر ميباشد. به همين دليل تلاشهاي بسياري در جهت بهبود اين محيطها صورت پذيرفته است. اولين محيط تخصصي کشت رويان (شامل 9 ترکيب) در سال 1956 توسط Whitten ساخته و رشد رويان 8 سلولي موش تا مرحلهي بلاستوسيست در اين محيط گزارش شد. مطالعات بعدي توسط Biggers (Biggers et al., 1967) نشان داد که تکوين سلول تخم موش تا مرحلهي دو سلولي، وابسته به حضور پيروات در محيط کشت است (Summers and Biggers, 2003). از آنجايي که رويان تا مرحلهي 8 سلولي به جاي گلوکز، از پيروات و لاکتات به عنوان منبع انرژي استفاده ميکند و حضور گلوکز در محيطهاي ساده موجب تاخير يا توقف در تکوين ميشود، محيط کشت CZB در سال 1989 توسط Chatot روي کار آمد. اين محيط که حاوي EDTA57، ميزان افزايش يافتهي پيروات، لاکتات و همچنين گلوتامين جايگزين گلوکز بود ، موجب گذر رويان برخي نژادهاي موش، از توقف موجود در مرحلهي دو سلولي و رشد آنها تا مرحلهي بلاستوسيست شد (Chatot et al., 1989). در سال 1992 محيط کشت SOM58 توسط Lawitts و Biggers ساخته شد که بعدها پس از افزايش غلظت NaCl و KCl،KSOM59 نام گرفت (جدول ‏1-2).
اين محيط، رشد سلول تخم تا مرحلهي بلاستوسيست را بهتر از محيطهاي قبلي حمايت ميکند و تا به امروز يکي از پرکاربردترين محيطها در زمينهي کشت رويان موش به حساب ميآيد (Lawitts and Biggers, 1993).
جدول ‏1-2: ترکيبات محيط KSOM ساخته شده توسط Lawitts و Biggers (Lawitts and Biggers, 1993).
Concentration
gr/literComponent5.55NaCl0.186KCl0.0476KH2PO40.0493MgSO41.87Lactate0.022Pyruvate 0.036Glucose0.146Glutamine 1BSA0.0038EDTA2.10NaHCO30.251CaCl2 . 2H2O
1-2-3 انجماد60
يکي از پيشرفتهاي تکنيکهاي کمک باروري در دهههاي اخير، انجماد است. اين تکنيک در مواردي که تعداد رويانهاي حاصل از لقاح آزمايشگاهي، بيش از تعداد مورد نياز جهت انتقال به رحم باشد، مورد استفاده قرار ميگيرد. در اين حالت اگر دورهي درماني با شکست مواجه شود، ميتوان از رويانهاي منجمد شده، در دورههاي بعدي استفاده گردد و احتياجي به تکرار کامل مراحل درماني نميباشد. انجماد همچنين براي حفظ تخمک خانمهايي که فعاليت تخمدان آنها به دلايل مختلف مانند بيماريهاي لگني و درمانهاي کلينيکي همچون شيمي درماني کاهش مييابد و يا تخمکهاي آنها آسيب ميبيند، مناسب ميباشد (Porcu et al., 1997, Tucker et al., 1998).
1-2-3-1 اصول انجماد
سلولهاي زنده، به منظور ذخيرهي طولاني مدت، بايد به حالتي از حيات معلق61 درآيند که با گذشت مدت زمان نامعلوم، قابليت بازگشت به حالت طبيعي و ادامهي حيات را داشته باشند. به اين منظور، از دماهاي پايين استفاده ميشود. به طور کلي دمايي که براي ذخيرهي سلولهاي پستانداران استفاده ميشود، ?C 196- (دماي نيتروژن مايع) است که به نظر ميرسد براي اين هدف کافي باشد. زيرا در اين دما، آب تنها به حالت جامد وجود دارد و هيچ گونه واکنش بيولوژيک شناخته شدهاي رخ نميدهد (Mazur, 1980). از آنجايي که رويان پستانداران در دماي ?C37 زنده ميماند و هيچ فعاليت بيولوژيکي در دماي ?C 196- اتفاق نميافتد، محدودهي خطرناک براي رويان در طول فرايند انجماد، طي انتقال دما ميباشد. يعني در طول سرد شدن تا دماي ?C 196- و در طول فرايند گرم شدن62 دوباره تا دماي ?C 37. هنگامي که آب به زير نقطهي انجماد سرد ميشود، ساختار جامد کريستالي ايجاد ميکند که به عنوان يخ شناخته ميشود. از آنجا که تراکم يخ از آب مايع کمتر است، بنابراين حجم بيشتري نسبت به آب مايع اشغال ميکند و منجر به ايجاد فشار و نيروهاي شکننده روي اندامکهاي درون سلولي ميشود. بنابراين پيشگيري از تشکيل کريستال يخ، يکي از رموز اصلي در انجماد موفق است (Mazur, 1963). وقتي آب مايع به يخ تبديل ميشود، هر مادهي محلول در فاز مايع از قسمت جامد جدا ميماند. اين مواد، نقطه انجماد محلول باقي مانده و منجمد نشده را پايين ميآورند. با ادامهي اين فرايند، غلظت الکتروليتها و ساير مواد حل شده به سطوح بالايي ميرسد که ميتواند براي پروتئينهاي داخل سلولي سمي باشد. بنابراين پيشگيري از اثر محلول63، دومين نکتهي کليدي در انجماد موفق است (Lovelock, 1954). در طول فرايند گرم کردن، ذوب شدن يخ جامد و رها شدن آب آزاد، منجر به کاهش اسمولاريته محلول اطراف آن ميشود. اگر فرايند گرم شدن، آهسته باشد، خطر اينکه آب آزاد دوباره به کريستال تبديل شود زياد است، که اين امر آسيبهاي بعدي را ايجاد ميکند و در صورتي که اين فرايند سريع انجام شود، فشار اسمزي ايجاد شده ممکن است منجر به انتقال ناگهاني آب از طريق غشا به داخل سلول و در نتيجه تورم و آسيب به سلول گردد (Mazur, 1980). اين پديده، شوک اسمزي نام دارد و پيشگيري از آن، سومين رمز انجماد موفق است. بنابراين فقط فرو بردن سلول يا رويان، درون نيتروژن مايع، منجر به موفقيت در انجماد نميشود و سه اصل ذکر شده در بالا بايد رعايت گردد. به همين جهت، در تمامي روشهاي انجماد، از مواد شيميايي خاصي به نام عوامل سرما محافظ64 استفاده ميشود (Meryman, 2007).
1-2-3-2 مواد سرما محافظ
مواد سرما محافظ، ترکيبات شيميايي محلول در آب هستند که در انجماد، به عنوان ضديخ مورد استفاده قرار ميگيرند و موجب افزايش نرخ زندهماني سلولها طي اين فرايند ميشوند. اين مواد را ميتوان در دو گروه نفوذپذير65 يا داخل سلولي66 و نفوذناپذير67 يا خارج سلولي68 دستهبندي کرد (Jain and Paulson, 2006).
مواد سرما محافظ نفوذناپذير، که اولين بار توسط Kasai و همکارانش (Kasai et al., 1981) مورد استفاده قرار گرفنتد، اغلب ملکولهاي قندي بزرگي هستند که قابليت ورود به سلول را ندارند. در طي فرايند انجماد، اين مواد با ايجاد شيب اسمزي، آب داخل سلول را به بيرون ميکشند و موجب چروکيدگي سلول ميگردند. هرچند کاهش آب داخل سلول، موجب کاهش تشکيل کريستالهاي يخ ميشود، اما بايد توجه کرد که خروج آب سلول به مقدار زياد، باعث افزايش غلظت ترکيبات داخل سلولي و ايجاد اثر محلول ميشود که اين حالت براي سلول کشنده است. براي تعديل اين اثر، ميتوان در محيطهاي انجمادي از عوامل سرما محافظ نفوذپذير استفاده نمود. ضديخهاي نفوذپذير، ملکولهاي کوچکي هستند که به آساني و به سرعت از غشاي سلول عبور ميکنند. بنابراين با ورود به سلول، موجب حفظ اسمولاريتي داخل سلولي و بازگشت مقداري از آب خارج شده به سلول ميشوند (Fasano, 2013). علاوهبراين، با قرارگيري بين ملکولهاي آب و افزايش گرانروي69، حرکت ملکولهاي آب را کاهش ميدهند و در نقطهي انجماد، به دليل اتصالي که با اين ملکولها ايجاد کردند، مانع تشکيل کريستال يخ ميشوند (Nash, 1962).
در فرايند ذوب، ضديخهاي نفوذ ناپذير نقش بسيار مهمي دارند. استفاده از اين مواد در محيطهاي ذوب و بنابراين حضورشان در فضاي خارج سلولي، از ورود ناگهاني آب به داخل سلول و ايجاد شوک اسمزي جلوگيري ميکند (Schneider and Mazur, 1984). بنابراين براي افزايش بازده فرايند انجماد-ذوب، بايد ترکيبي از هر دو گروه ضديخ استفاده شود.
از ضديخهاي نفوذناپذير ميتوان به ساکاريدهايي همچون ساکارز70، ترهالوز71 و ماکروملکولهايي مانند پلي وينيل الکل72 و پلي وينيل پيروليدون73 اشاره کرد. اتيلنگليکول74، گليسرول75 و دي متيل سولفوکسيد76 نيز، از جمله ضديخهاي نفوذپذير پرکاربرد هستند (Fasano, 2013). از آنجايي که برخي ضديخها براي سلول سمي هستند و نميتوان غلظتهاي بالايي از آنها را مورد استفاده قرار داد، بهتر است از ترکيب چند ضديخ با غلظت پايينتر استفاده نمود. به اين ترتيب ميتوان تاثيرات سمي غلظتهاي بالاي هريک از آنها را کاهش داد. به اين عمل، خنثيسازي سميت مواد سرما محافظ77 ميگويند (Tucker and Liebermann, 2007). علاوه بر اين مشاهده شده است که نفوذ پذيري ترکيبي از چند ضديخ، نسبت به نفوذپذيري هريک از آنها به تنهايي، به طور معني داري بالاتر است (Vicente and Garcia-Ximenez, 1994).
1-2-3-3 روشهاي انجماد
جهت حفظ و ذخيرهي سلول و رويان، دو روش انجماد آهسته78 و انجماد شيشهاي79، مورد استفاده قرار ميگيرند. اين دو روش از نظر نحوهي ذخيره، ذوب و آبدهي تا حدودي مشابه ولي از نظر غلظت ضديخهاي مورد استفاده و مرحلهي انجماد کاملا متفاوت ميباشند (Karlsson, 2002).
1-2-3-3-1 انجماد آهسته
اساس اين روش، کاهش دما به صورت آهسته و کنترل شده تا ?C 196- ميباشد که به اين منظور از يک دستگاه فريزر قابل برنامهريزي80 استفاده ميشود. در انجماد آهسته، نمونه پس از متعادلسازي در محيطي با غلظت پايين مواد سرما محافظ، درون ني پلاستيکي مخصوص قرار گرفته و طي چند مرحله سرد ميشود.
سرعت سرد شدن نمونه طي اين فرايند، ابتدا ?C/min 2- و در ادامه ?C/min 3/0- تا 6/0- ميباشد. با رسيدن دما به محدودهي ?C 30- تا 60-، ني حاوي نمونه درون ازت مايع برده شده و نگهداري ميشود (Cutting et al., 2009).
انجماد آهسته براي اولين بار در سال 1972 بر روي رويان موش انجام گرفت و نوزاد حاصل از انتقال مرولاي منجمد-ذوب شده متولد گرديد (Whittingham et al., 1972). مطالعات بعدي، منجر به بهبود و توسعهي اين تکنيک و ورود آن به حوزهي انساني شد. به طوريکه در سال 1983، اولين بارداري موفقيت آميز در مورد انتقال رويان انساني منجمد-ذوب شده اعلام گرديد (Trounson and Mohr, 1983). عليرغم پيشرفتهايي که در انجماد آهسته صورت گرفته است، امروزه اين روش در زمينهي انجماد سلول و رويان کاربرد زيادي ندارد. زيرا انجماد آهسته، علاوه بر اين که روشي زمانبر و گران قيمت است، براي انواع سلولها و رويانها نيز مناسب نميباشد. همچنين با وجود اين که نمونه با سرعت کمي از ناحيهي خطر عبور کرده و مجال جابجايي محلول، بين محيط خارج و داخل سلول مهيا است و شوک اسمزي شديدي رخ نميدهد، به نظر ميرسد غلظت پايين مواد سرما محافظ مورد استفاده، براي ممانعت از تشکيل کريستال يخ کافي نيست. اين امر در نهايت منجر به آسيب سلولي خواهد شد (Vajta and Kuwayama, 2006). بنابراين براي برطرف کردن نواقص اين روش، انجماد شيشهاي بر پايهي دو اصل، غلظت زياد مواد سرما محافظ و سرعت بالاي سرمادهي81 و گرمادهي82 روي کار آمد.
1-2-3-3-2 انجماد شيشهاي
انجماد شيشهاي، به معني انجماد محلول، بدون تشکيل کريستال يخ (شکل ‏1-13) در دماي پايين ميباشد، که اين امر با افزايش غلظت مواد سرما محافظ و نرخ سرمادهي بالا امکان پذير است. به طور خلاصه، در اين روش ابتدا رويانها در يک محلول حاوي عوامل سرما محافظ با غلظت پايين قرار ميگيرند که منجر به از دست دادن آب و نفوذ ضديخ به درون سلولها ميشود، در مرحلهي بعد رويانها به مدت خيلي کوتاه (حدود يک دقيقه) درون غلظت بالاتري از ضديخ قرار گرفته و در ادامه توسط حاملهاي انجماد، به درون ازت مايع منتقل ميشوند. بنابراين در اين روش، نمونه با سرعت زيادي (?C/min 30000-15000) از ناحيهي خطر عبور کرده و به يکباره تا دماي ?C 196- سرد ميشود. فرايند ذوب نيز با سرعت و به کمک رقيقسازي محلولهاي حاوي ساکارز انجام ميگيرد (Mukaida and Oka, 2012).
شکل ‏1-13: فرايند شيشهاي شدن محيط انجماد در حضور مواد سرما



قیمت: تومان


پاسخ دهید