دانشگاه آزاد اسلامي
واحد اروميه
دانشکده علوم پايه، گروه زيست شناسي
پايان نامه براي دريافت درجه کارشناسي ارشد
رشته : زيست شناسي
گرايش: ميکروبيولوژي
عنوان:
کلونينگ، بيان، تخليص و بررسي فعاليت آنزيم سراپپتيداز حاصل از سراشيا مارسسنس
استاد راهنما:
دکتر خسرو خواجه
استاد مشاور:
دکتر صادق حسن نيا
نگارش:
الهام حسني
تابستان 1392
چکيده
پروتئازها از مهم ترين آنزيم هاي صنعتي هستند که حداقل يک چهارم توليدات آنزيمي در سطح جهان را به خود اختصاص داده اند. سراشيا مارسسنس پروتئاز خارج سلولي قوي به نام سراپپتيداز توليد مي کند. اين آنزيم يک متالوپروتئاز حاوي روي است و شامل ??? اسيد آمينه و جرم مولکولي50632 دالتون مي باشد و در درمان تورم پس از ضربه و بيماري هاي پستان فيبروسيس و برونشيت بسيار مفيد مي باشد.
در اين مطالعه ابتدا جداسازي سراشيا مارسسنس مولد آنزيم سراپپتيداز صورت گرفت و توالي ژن سراپپتيداز از بانک ژني NCBI بدست آمد و طراحي پرايمر صورت گرفت. پس از استخراج DNA ژنومي باکتري سراشيا مارسسنس به روشBoiling ، به عنوان الگو در تکثير PCR مورد استفاده قرار گرفت و پس از تاييد محصول PCR، ژن تکثير يافته در وکتور TA کلون و سپس درون وکتور بياني PET28 ساب کلون گرديد .کلون انجام شده توسط برش آنزيمي، PCRو تعيين توالي تاييد شد و پلاسميد نوترکيب با آنزيم Nde1 و Xho1 خطي شده وE.coli سويه BL21 توسط وکتور نوترکيب ترانسفورم و بيان پروتئين تحت القايIPTG و الکتروفورزSDS-PAGE مورد ارزيابي قرار گرفت و با استفاده از ستون کروماتوگرافي نيکل-سفارز آنزيم مورد نظر تخليص گرديد.
آنزيم داراي pH بهينه 7 و دماي بهينه 55 درجه است. با رسم نمودار Michaelis-Menten محاسبه Km و Vmax صورت گرفت. مقادير km و Vmax براي سوبستراي کازئين به ترتيب mM 04/0 و((mM/min 177/0 مي باشد.
کلونينگ، بيان و تخليص و تعيين ساختار ژن سرپپتيداز در اين مطالعه تاييد مي شود. اين پروتئين نوترکيب مي تواند در مطالعات آينده در صنايع دارويي مورد استفاده قرار گيرد.
كلمات كليدي:
پروتئاز، سراپپتيداز، كلونينگ، بيان، تخليص، فعاليت، پايداري ، سراشيا مارسسنس
تقديم به
پدر و مادر عزيز و مهربانم که در سختي ها و دشواري هاي زندگي همواره ياوري دلسوز و فداکار و پشتيباني محکم و مطمئن برايم بوده اند…
سپاس و ستايش خداي عزوجل که آثار قدرت او بر چهره روز روشن، تابان است و انوار حکمت او در دل شب تار، درخشان. آفريدگاري که خويشتن را به ما شناساند و درهاي علم را بر ما گشود و عمري و فرصتي عطا فرمود تا بدان، بنده ضعيف خويش را در طريق علم و معرفت بيازمايد.
در اينجا وظيفه خود مي دانم از زحمات بي دريغ استاد راهنماي ارجمندم جناب آقاي دکتر خواجه به سبب راهنمايي ها و کمک هاي ارزنده شان در به انجام رسانيدن اين پايان نامه و نيز امکاناتي که در اختيارم قرار دادند، تشکر فراوان نمايم.
از جناب آقاي دکترحسن نيا که مشاوره اين پايان نامه را به عهده داشتند، سپاسگذارم.
از سرکار خانم دکتر دبيرمنش و بويژه سرکار خانم دکتر اکبري به دليل ياري ها و راهنمايي هاي بي چشمداشت شان نهايت تشکر را دارم و از يکايک دوستانم در آزمايشگاه بيوشيمي دانشگاه تربيت مدرس که در طول اين پايان نامه مرا ياري کردند، سپاسگذارم. از آقاي دکتر نژاد ستاري رئيس محترم دانشکده علوم پايه ), واحد علوم تحقيقات تهران) که داوري اين پايان نامه را پذيرفتند و در جلسه دفاع حاضر شدند متشکرم.
فهرست مطالب
عنوان شماره صفحه
چکيده
فصل اول : کليات
1-1مقدمه…………………………………………………………………………………………………. 2
1-2 بيان مسئله، اهميت و ضرورت تحقيق………………………………………………………………….5
1-2-1 آنزيم ها5
1-2-2 غربالگري screeningآنزيم ها واهميت آن6
1-2-3 منابع آنزيمي7
1-2-3-1 ميکروارگانيزم ها به عنوان عمده ترين منابع آنزيمي7
1-2-3-2 موقعيت تاکسونوميک توليد کننده هاي شناخته شده آنزيمي8
1-2-3-3 ميکروارگانيسم هايGRAS8
1-2-4 کلکسيونهاي ميکروب (Culture Collection)به عنوان منابع ميکروارگانيسم ها9
1-2- 5 بازار جهاني آنزيم10
1-2-6 پروتئازها11
1-2-6-1 اعمال پروتئازها12
1-2-6-2 دسته بندي پروتئازها17
1-2-7 کاربرد پروتئازها22
1-2-7-1 صنعت شوينده22
1-2-7-2 صنعت چرم23
1-2-7-3 صنايع دارويي24
1-2-7-4 صنايع غذايي25
1-2-8 سراشيا مارسسنس26
1-2- 9 سراشياپپتيداز و اهميت آن28
1-2-10 روشهاي DNA نوترکيب و اهميت آن29
1-2-11 انتخاب ميزبان بيان ژن30
1-2- 12راهبردهاي نسخه برداري (انتخاب حاملين بيان ژن)31
1-2-13 سيستم بيانpET32
1-2-14استراتژي خالص سازي محصول نوترکيب34
هدف از انجام پروژه36
فصل دوم: پيشينه پژوهش
2-1 ادبيات و سوابق مربوطه………………………………………………………………………………39
فصل سوم: روش شناسي
3-1مواد شيميايي42
3-2 ميكروارگانيسم ها ومحيط هاي كشت مورد استفاده43
3-2-1 ميكروارگانيسم ها و پلاسميدها43
3-2-2محيط هاي كشت ميكروبي44
3-3 روش سنجش فعاليت پروتئاز45
3-4 مطالعات اوليه آنزيم شناسي46
3-4-1 اثر دما بر پايداري آنزيم46
3-4-2 اثر pH بر پايداري آنزيم46
3-4-3 دماي بهينه47
3-4-4 تعيين پارامترهاي سينتيكي آنزيم47
3-5 جداسازي باکتري48
3-5-1 استخراج DNAژنومي48
3-5-2 طراحي پرايمر و انجام PCR48
3-5-2-1 مراحل PCR ……………………………………………………………………………..49
3-5-3 کلون سازي ژن سراپپتيداز در وکتورT/A 50
3-5-4 رسم درخت فيلوژنتيک51
3-5-5 تعيين توالي ژن کدکننده سراپپتيداز51
3-6 روشهاي الکتروفورزي53
3-6-1 SDS-PAGE53
3-6-2 الکتروفورز ژل آگارز(100)53
3-7 فنون مربوط به DNA نوتركيب54
3-7-1 ساختار ناقل كلونينگ54
3-7-2 آماده سازي قطعهDNA براي انتقال به درون وكتور55
3-7-3 استخراج DNA از روي ژل56
3-7- 4 مراحل کلون مجدد56
3-7-5 مستعدکردن باکتري DH5?به روش استفاده از محلول CaCl2 (M 1/0)58
3-7-6 انتقال محصول الحاق به درون باکتري مستعدDH5? 59
3-8 بافرCracking60
3- 9بيان ژن سراپپتيداز و تعيين خلوص آن توسطSDS-PAGE 62
3-9-1 القاء باکتري و بيان پروتئين هاي نوترکيب62
3-9-2 بررسي بيان پروتئين هاي نوترکيب با استفاده از روش الکتروفورز63
3-10 تخليص پروتئين هاي نوترکيب66
3-10-1 بافرهاي موردنياز تخليص پروتئين نوترکيب66
3-10-2 روش تخليص پروتئين نوترکيب67
فصل چهارم: تجزيه وتحليل داده ها
4-1 جداسازي باکتري70
4-2 استخراج DNAژنومي70
4-3 رسم درخت فيلوژنتيکي70
4-4 کلون کردن ژن سراپپتيداز در حامل بيانيpET28-a (+)71
4-5 بيان و تخليص ژن سراپپتيداز نوترکيب75
4-6 منحني استاندارد77
4-7 اثر pH روي فعاليت آنزيم77
4-8 دماي بهينه آنزيم78
4 -9 بررسي خصوصويات کاتاليتيک آنزيم……………………………………………………………….79
فصل پنجم: بحث و نتيجه گيري
5-1 نتيجه گيري نهايي88
5-2 پيشنهادات88
منابع و مأخذ89
فهرست منابع انگليسي……………………………………………………………………………………..89
فهرست جداول
عنوان شماره صفحه
جدول 3-1 خصوصيات انواع سويه ها و پلاسميدهاي مورد استفاده در پژوهش …………………………………43
جدول 3-2 نسبت هاي واکنش الحاق …………………………………………………………………………………………..57
فهرست اشکال
عنوان شماره صفحه
شکل 1-1 سيستم بيان pET ……………………………………………………………………………………………………….34
شکل 2-1 ناقل کلونينگPet28a…………………………………………………………………………………………………55
شکل 4-1 درخت فيلوژنتيکي رسم شده با استفاده از NCBI…………………………………………………………..71
شکل 4-2 الکتروفورز محصول واکنش PCR…………………………………………………………………………………72
شکل 4-3 الکتروفورز پلاسميد هاي استخراج شده از باکتريهاي ترانسفورم شده توسط روش Cracking………………………………………………………………………………………………………………………………..73
شکل 4-4 نمونه هاي پلاسميدي حاوي ژن…………………………………………………………………………………….74
شکل 4-5 محصول واکنش PCR…………………………………………………………………………………………………75
شکل 4-6 ژل الکتروفورز آنزيم تخليص شده ………………………………………………………………………………..76
فهرست نمودارها
عنوان شماره صفحه
نمودار 4-7 منحني استاندارد غلظت تيروزين …………………………………………………………………………………77
نمودار 4-8 تأثير pH بر روي فعاليت سراپپتيداز …………………………………………………………………………….78
نمودار 4-9 اثر دما بر روي فعاليت سراپپتيداز ………………………………………………………………………………..79
نمودار 4-10 منحني ميکائيليس-منتن از فعاليت پروتئازي ……………………………………………………………….80
فصل اول
کليات
مقدمه
پروتئازها از مهم ترين آنزيم هاي صنعتي هستند که حداقل يک چهارم توليدات آنزيمي در سطح جهان را به خود اختصاص داده اند و بطور گسترده در صنايع مختلف از جمله موادغذايي، موادشوينده، داروسازي، چرمسازي و… مورد استفاده قرار مي گيرند (Ghaemi et al, 2005). از جمله موارد حائزاهميت کمبود اين آنزيم، قليايي شدن بيش از حد خون مي باشد بطوريكه قليايي شدن اين محيط باعث اضطراب و بي خوابي مي شود وهم چنين کمبود آن سبب ورم مفاصل و پوکي استخوان وديگر بيماري هاي کمبود کلسيم مي شود. از آنجايي که پروتئين تبديل به گلوکز مي شود و هضم پروتئين ناکافي منجر به هيپو گليسمي مي شود. با توجه به مطالب فوق از ميان پروتئازهاي ميکروبي، سراشيا مارسسنس پروتئاز خارج سلولي قوي به نام سراپپتيداز توليد مي کند و پزشکان در سراسر اروپا و آسيا مزاياي ضد التهابي و ضد درد اين ماده را به رسميت شناخته اند و از آن به عنوان جايگزين ساليسيلات ها، ايبوپروفن و ساير داروهاي ضد درد غيراستروئيدي در درمان استفاده مي شود ( Mazzone ,1990).
منابع توليد آنزيمها بسيار متنوع است. بطوريکه از صد ها آنزيمي که بطور تجاري استفاده مي شود بيش از نيمي از آنها از قارچ و مخمر و بيش از يک سوم آنها از باکتري ها و باقي مانده از گياهان و حيوانات حاصل مي شود. بنا به دلايل زير ميکروبها به عنوان منابع آنزيمي نسبت به گياهان و جانوران ترجيح داده مي شوند:1- عموما توليد آنها ارزانتر است 2- آنزيمهاي حاصل از آنها قابل پيش بيني و قابل کنترل تر هستند، 3- بافتهاي گياهي و جانوري نسبت به ميکروارگانيسم ها مواد مضر بيشتري دارند (مانند ترکيبات فنلي در گياهان، مهارکننده هاي داخل سلولي و پروتئازها)، 4- نسبت به گياهان و جانوران راحت تر مي توان ميکروب ها را از نظر ژنتيکي دستکاري نمود، 5- ميکروارگانيزم ها را مي توان در مقادير بالا و در يک مدت زمان نسبتا کم از طريق روشهاي تخمير کشت داد 6- پروتئين هاي ميکروبي اغلب نسبت به همتاهاي جانوري و گياهي خود پايدارترند. 7-منابع قابل اعتمادي از مواد اوليه جهت رشد آنها به راحتي فراهم ميشود. بطور کلي مي توان گفت محدوديت توليد آنزيم هاي حيواني و گياهي از يک سو و توليد ناکافي اين منابع براي پاسخ به در خواست جهاني توليد آنزيم و توجه را به سوي آنزيم هاي ميکروبي معطوف کرده است (Kroner, 1984).
امروزه آنزيم ها در صنايع مختلف کاربردهاي فراواني دارند بطوريکه در سال ???? بازاري معادل ?.? بيليون دلار آمريکا صرف خريد آنزيم براي استفاده در صنايع گوناگون شده است. از ميان آنزيم ها آنزيم هايي که نقش هيدروليز کننده دارند مانند پروتئازها، آميلاز، استراز و ليپازها حائز بيشترين اهميت مي باشد. در اين ميان ??? از سهم فروش ساليانه آنزيمي (معادل ????-????تن در سال) مربوط به پروتئازها مي باشد. پروتئازها در صنايع گوناگون کاربرد دارند. بخش عمده اي از کاربرد آنها در شوينده ها به عنوان افزودني و مابقي در صنايع غذايي، دارويي، چرم و تشخيص پزشکي استفاده مي شود (Gupta, 2004). از ميان پروتئازهاي ميکروبي، سراشيا مارسسنس پروتئاز خارج سلولي قوي به نام سراپپتيداز توليد مي کند که اين آنزيم هم چنين با نام هاي سراليزين و سراشياپپتاز و سراشيو پپتيداز شناخته مي شود. سراپپتيداز متالوپروتئاز حاوي روي خارج سلولي و شامل ??? اسيد آمينه و با جرم مولکولي63250 دالتون مي باشد که توسط انتروباکتريوم سراشيا غير پاتوژن E15 توليد مي شود. اين ميکروارگانيسم در ابتدا در اواخر ??6? از روده کرم ابريشم جدا شد (Hase& Finkelstein , 1993).
اين آنزيم به دليل توانايي آن در درمان انسداد شرياني در بيماران مبتلا به بيماري عروق کرونر به عنوان آنزيم معجزه توصيف مي شود (Raskin, 1999). سراپپتيداز داراي خواص ضد التهابي قوي و در درمان تورم پس از ضربه و بيماري هاي پستان فيبروسيس و برونشيت بسيار مفيد است. کاهش درد از ديگر ويژگي هاي آن است که علت آن توانايي در جلوگيري از آزاد شدن آمين ها يا القاکننده درد از بافتهاي ملتهب است (Mazzonie et al, 1990). بنابراين با توجه به مزاياي فوق ميتوان ازآن به عنوان يک آنزيم دارويي استفاده کرد.
1-2 بيان مسئله و ضرورت تحقيق
1-2-1 آنزيم ها
موجودات زنده به لحاظ دارا بودن کاتاليزورهاي زيستي که اصطلاحا آنزيم ناميده مي شوند، قادر به کسب انرژي از محيط و مصرف سريع آن مي باشند. همچنانکه در مورد کاتاليزورهاي معدني مشاهده مي شود. آنزيم ها قادر به تسريع واکنش هاي شيميايي بوده وليکن در تعادل نهايي شرکت نمي کنند. برخلاف کاتاليزورهاي معدني، آنزيم هاداراي دامنه عمل بسيار ظريفي هستند و در مقايسه، دامنه بسيار محدودي از مواد را کاتاليز مي کنند و يا اينکه در بعضي موارد تنها يک واکنش را کاتاليز مي کنند. آنزيم ها بنا به تعريف در شرايط خاصي از pH، درجه حرارت و غلظت سوبسترا بهينه فعاليت دارند و ممکن است به کوفاکتورهاي ويژه اي نياز داشته باشند.
آنزيم ها بر حسب نوع واكنشي كه انجام مي دهند به 6 گروه اصلي تقسيم بندي مي شوند:
اكسيدوردوكتازها
ترانسفرازها
هيدرولازها
ليازها
ايزومرازها
ليگازها
1-2-2 غربالگري ((screening آنزيم ها و اهميت آن
با غربالگري ارگانيسم ها به منظور فعاليت هاي بيوكاتاليزي مختلف، مي توان محصولات توليد شده توسط آنها را كه نسبت به وظايف خود در خلال فرايند تكامل سازش يافته اند به دست آورد.بنابراين غربالگري از جنبه هاي مختلف يك سرمايه گذاري مناسب محسوب مي گردد (Dalboge& Dalboge,1998). غربالگري بيوكاتاليست هاي جديد با اهداف آكادميك و علوم پايه و يا به منظورهاي كاربردي-صنعتي صورت مي گيرد (Xuyang et al, 1995). منابع توليد كننده آنزيم ها بسيار متعدد هستند. اما ميكروارگانيسم ها بنا به دلايلي كه به آنها اشاره خواهد شد مهمترين و عمده ترين منبع توليد كننده آنزيم ها هستند كه مد نظر مي باشند. فرآيند هاي اوليه در تحقيقات و به دست آوردن يك انتخاب1 و غربالگري2 محصول آنزيمي مي باشند. جستجو به منظور يافتن يك ژن كد كننده ويژه براي آنزيم هدف، داراي اهميت ويژه است. در گذشته اين فرآيند منحصرا شامل غربالگري ميكروارگانيسم هاي زنده بود. (غربالگري ميكروبي كلاسيك). اما با بكار گيري روش هاي نوين بيولوژي مولكولي، غربالگري بدون نياز به كشت ارگانيسم ها قابل انجام مي باشد (Richardson et al, 2002 ). البته هر روشي داراي محدوديت هايي است و تركيبي از تكنيك ها (combinational screening) اغلب بسيار موفقيت آميز است (Aehle, 2004). براي شروع فرآيند جستجو و كشف، تنوع عظيم از ميكروارگانيسم ها در طبيعت بهترين مژدگاني است (Kristjansson&Gudmundur, 1995).
تنوع متابوليکي به وجود آمده در 85% از تاريخ زمين که حيات محدود به ميکرو ارگانيسم ها است واقعا شگفت انگيز است. در غربالگري جمع آوري نمونه ها از منابع طبيعي مي تواند بدون هيچ تمايزي صورت گيرند (مثل نمونه هاي خاک) يا شرايط اکولوژيک در اين بررسي مورد توجه قرار گيرد و يک جستجوي هدفدار از يک زيستگاه خاص و ويژه که احتمال يافتن يک فعاليت آنزيمي يا يک خصوصيت آنزيمي ويژه در آن وجود دارد انجام شود. در صورتيکه منابع مورد جستجو و کاوش قبلا کمتر مورد بررسي قرار گرفته باشند و يا جديدا کشف شده باشند، احتمال دستيابي به تنوع بيشتر ژنومي و استخراج ميکروب هاي جديد (novel) بسيار افزايش مي يابد. در کنار موارد فوق راهکارهايي که بر اساس تاکسونومي مي باشد و شامل بررسي سيستماتيک از ارگانيزم هاي شناخته شده است نيز مي تواند موفقيت آميز باشد. امروزه غربالگري با تکنيک هاي جديد نظير تکامل جهت يافته3دستيابي به فعاليت هاي جديد، خصوصيات جديد و بهبود بيوکاتاليست ها از جنبه هاي مختلف، همچنين پي بردن به مکانيسم هاي دخيل در آنها شتاب بيشتري گرفته است (Ashie , 2003) و (Bronscheuer& Pohl, 2001 ).
1-2-3 منابع آنزيمي
1-2-3-1 ميکروارگانيزم ها به عنوان عمده ترين منابع آنزيمي
منابع توليد آنزيمها بسيار متنوع است. ميکروارگانيزم ها به عنوان عمده ترين و مهمترين منبع توليد آنزيمها محسوب مي گردند. در صنعت منابع جانوري و گياهي به ترتيب تنها %8 و %3 از کل آنزيمها را شامل مي شوند و ساير آنزيم هاي مورد استفاده منشأ ميکروبي دارند (Horikoshi, 1995). بنابه دلايل زير ميکروبها به عنوان منابع آنزيمي نسبت به گياهان و جانوران ترجيح داده مي شوند:1- براي توليد عموما ارزانند، 2- آنزيمهاي موجود در آنها بيشتر قابل پيش بيني و کنترل هستند، 3- بافتهاي گياهي و جانوري مواد مضر بيشتري دارند (مانند ترکيبات فنلي در گياهان، مهارکننده هاي داخل سلولي و پروتئازها)، 4- نسبت به گياهان و جانوران راحت تر مي توان ميکروب ها را از نظر ژنتيکي دستکاري نمود، 5- ميکروارگانيزم ها را مي توان در مقادير بالا و در يک مدت زمان نسبتا کم از طريق روشهاي تخمير کشت داد. 6- پروتئين هاي ميکروبي اغلب نسبت به همتاهاي جانوري و گياهي خود پايدارترند (Waites et al 2001).
با پيدايش تکنولوژي DNA نوترکيب و نيازهاي جديد، ميکروارگانيسم ها به عنوان منابع آنزيمي حتي اهميت بيشتري يافته اند. جستجو و يافتن بيوکاتاليست ها، هم با اهداف آکادميک و هم با جنبه ها و اهداف کاربردي صورت مي گيرد. در هر دو حالت ميکروارگانيسم ها ارجحيت دارند. اين امر اگر با اهداف آکادميک صورت گيرد محقق اغلب از دامنه وسيعي از منابع، انتخاب را انجام مي دهد. اين ميکرو ارگانيسمها متعلق به هر سه حوزه Eukaryotes , Bacteria , Archaea مي باشند.
1-2-3-2 موقعيت تاکسونوميک توليد کننده هاي شناخته شده آنزيمي
جالب است که اغلب آنزيمهاي ميکروبي قابل تجاري شدن در تعداد معدودي از جنس هاي قارچي و باکتريايي يافت مي شوند و در نقاط خاصي از موقعيت هاي تاکسونوميک تجمع يافته اند. شناخته شده ترين آنها عمدتا متعلق به گونه هاب باکترياييBacillus وPseudomonas و قارچهاي Ascomycete شامل جنس هايTricoderma,Fusarium ,Aspergillusهستند. بعلاوه گونه هاي متعلق به Rhizomucor Homicolarو Mucor توليد كننده برخي از آنزيم هاي صنعتي مي باشند.
1-2-3-3 ميکروارگانيسم هايGRAS
اغلب پروتئين ها و آنزيمهاي صنعتي مهم توسط تعداد معدودي از ارگانيسم ها که جزءGRAS
(generally recognized as safe) دسته بندي مي گردند، توليد مي شوند. ميکروارگانيسمهاي GRAS شامل باکتري هايي نظير Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis به علاوه ساير گونه هاي متعلق به bacilli, lactobacilli وstreptomyces مي باشند.
قارچ هاي GRAS شامل اعضاي گونه هاي جنس Aspergillus, Penicillum, MucorوRhizopus هستند. مخمرها نظير Saccharomyces cerevisae نيز GRAS مي باشند. ميکروبهاي GRASغير بيماريزا و غير سمي مي باشندو نبايد آنتي بيوتيک توليد نمايند (Kenddd& Cabral , 1987) و (Waites et al , 2001).
1-2-4 کلکسيونهاي ميکروب (Culture Collection)به عنوان منابع ميکروارگانيسمها
ميکروارگانيسمها را مي توان از طريق غربالگري يا کلکسيون سويه ها به دست آورد. اين کلکسيون ها در بسياري از آزمايشگاه هاي مرتبط با تکنولوژي آنزيمي جمع آوري و تهيه شده اند. به علاوه در بسياري از کشورها کلکسيون هاي ملي زير نظر دولت ايجاد شده اند. تقريبا 500 کلکسيون ميکروبي در سراسر دنيا وجود دارد. اين کلکسيون ها سرويس هايي را در اختيار سازمانهاي صنعتي و يا آکادميک قرار مي دهند. سويه ها عموما به صورت ليوفيليزه نگهداري مي شوند و در کنار آن c-DNA يا DNA ژنومي نيز در برخي موارد موجود مي باشد (Waites et al , 2001).
با وجود تکنولوژي DNA نوترکيب و روشهاي مبتني بر مهندسي ژنتيک، جستجوي ميکروارگانيسم هاي جديد يا فعاليت آنزيمي جديد هنوز هم بسيار حائز اهميت است.
ميکروارگانيسم ها يک راه حل عملي را براي بهبود فعاليت هاي آنزيمي پيش رو قرا مي دهند. در حال حاضر، عقيده بر اين است که براي توليد هر نوع محصول هدف يک ميکروارگانيسم يا کاتاليست آنزيمي مشتق شده از يک ميکرو ارگانيسم ميتوان از طبيعت بدست آورد. اگر چه ميکروارگانيسم ها با چشم غير مسلح ديده نمي شوند اما بيوسفر را تحت سلطه خود دارند. به عنوان مثال تخمين زده مي شود که يک گرم خاک مي تواند بالغ بر 4000 گونه باکتريايي مختلف داشته باشد (Torsvik et al, 1990). در حال حاضر تخمين ها براي تعداد کل گونه هاي ميکروبي روي زمين بين يك ميليون تا يكصد ميليون مي باشد اما تنها حدود 5000 گونه ميکروبي در منابع علمي آورده شده است (Short, 1997). از طرف ديگر روشهاي مهندسي ژنتيک با وجود تمام پيشرفت هايش با چالش هايي روبروست:
1- تاخوردگي ناصحيح پروتئين، 2- عدم گليکوزيلاسيون پروتئين هاي يوکاريوتي در باکتري ها، 3- حذف نشدن متيونين انتهاي آمين .گرچه مهندسي ژنتيک قادر به ايجاد آنزيمهاي جديد يا بهبود يافته مي باشد، طراحي ژنهاي جديد که توانايي هاي جديدي کد مي نمايند و طراحي، شناخت و بهبود خصوصيات آنزيمي از جنبه هاي فعاليت و پايداري بسيار مشکل مي باشد زيرا اطلاعات در دسترس و دانش ما در ارتباط با اساس مولکولي آنها ناچيز است. بنابراين يافتن منابع جديد و غربالگري ارگانيسم ها به منظور جداسازي بيوکاتاليستهاي جديد بسيار مهم بوده وبه عنوان يک روش اصلي در يافتن آنزيمهاي جديد باقي مانده است (Wahler& Reymond, 2001) و (Horikoshi, 1995).
1-2- 5 بازار جهاني آنزيم
بازار آنزيم موقعيتي مرکزي در اقتصاد جهاني پيدا کرده است بطوريکه توليد تجاري آنزيم يکي از پر سود ترين بازارهاست. در سال 1987، بازار جهاني آنزيم ، 450 ميليون دلار آمريکا و در سال 2008، حدود 3 ميليون دلار آمريکا و در دهه ي اخير رشد متوسط ساليانه، 9درصد بوده است.در اين ميان سه دسته آنزيم شناسايي شده است:
1. آنزيم هاي صنعتي (آميلازها، پروتئازها، کاتالازها، ايزومرازها، ليپازها، سلولازها و …)
2. آنزيم هاي مورد استفاده در تشخيص طبي ( گلوکز اکسيداز، الکل دهيدروژناز، هگزوکيناز، کلسترول اسيلاز و غيره)
3. آنزيم هاي مورد استفاده در داروسازي ( آسپاراژيناز، پروتئاز، ليپاز، استرپتوکيناز و غيره) (Crueger& Crueger, 1990).
1-2-6 پروتئاز ها
تاريخچه
حدود 30 سال قبل پروتئازها را به عنوان آنزيم هاي تجزيه کننده اي معرفي کردند که فقط مي توانند هيدروليز کلي پروتئين ها را انجام دهند. پيشرفت هاي اخير در روش هاي اندازه گيري و استفاده از سوبسترا هاي اختصاصي مشخص کرده است که آنزيم هاي هيدروليز کننده پروتئين تغييرات انتخابي و خيلي اختصاصي را در پروتئينها با هيدروليز محدود انجام مي دهند. بعلاوه پروتئازها نقش مهمي را در آزمايشگاه و کلينيک و همچنين در فرآيند هاي صنعتي ايفا مي کنند.
پروتئازها از دهه 1960 به عنوان مواد افزودني به شوينده ها مطرح شدند و استفاده تجارتي از آنها به سرعت توسعه پيدا کرد. به عنوان مهمترين آنزيم هاي صنعتي، پروتئاز ها حدود 60 درصد کل تجارت آنزيم ها را شامل مي شوند که دو سوم پروتئاز هاي تجاري توليد شده منشا ميکروبي دارند.
از مهمترين پروتئازهاي ميکروبي که به صورت تجاري موجود مي باشند، پروتئازهاي قليايي حاصل از
Bacillus licheniformis هستند که در توليد شوينده ها استفاده مي شوند، پروتئازهاي حاصل از Mucor که در توليد پنير کاربرد دارند و پروتئازهاي حاصل از Aspergillus oryzae که در تغيير خمير نان و توليد سس سويا استفاده مي شوند، اهميت دارند. اين پروتئاز ها به عنوان مهمترين آنزيم هاي داراي توليد بالا در جهان مطرح مي باشند. به هر حال، پروتئاز هاي ديگر ي نيز در فرآيندهاي مختلفي بخصوص در صنايع غذايي نقش دارند و بکار مي روند که در بين آنها پروتئاز هاي قارچي اهميت خاصي دارند.
1-2-6-1 اعمال پروتئازها
خصوصيات کلي:
داراي خصوصيات فيزيکي و شيميايي و کاتاليتيکي متفاوتند.
نقش در فرآيند متابوليکي و تنظيمي درارگانيسم هاي پروکاريوت و يوکاريوت دارند.
.پروتئازهاي خارج سلولي با تجزيه سوبستراهاي پلي پپتيدي بزرگ به مولکولهاي کوچک باعث تامين پپتيد ها و اسيد آمينه هاي ضروري براي رشد ميکروارگانيسم ها مي شوند.
پروتئاز هاي داخل سلولي نقش کليدي در تنظيم فرآيندهاي متابوليکي و همچنين نقش حياتي در بازيابي پروتئين دارند که تعادل بين سنتز و تخريب پروتئين را حفظ مي کند.
در کنترل بسياري از اعمال فيزيولوژيکي از جمله هضم مواد، تغييرات هورموني، تجمع پروتئين هاي ويروسي، پاسخ ايمني بدن، التهاب، باروري، انعقاد خون، از بين بردن لخته خون، کنترل فشار خون، بازيابي ديواره سلولي در باکتري ها، تشکيل اسپور در باکتري، تندش اسپور، جدا شدن کنيدي از کنيديوفور در قارچ ها و بيماري زايي نقش دارند. پروتئازها همچنين در تنظيم بيان ژن ها، ترميم DNA و سنتز DNA نقش دارند (Kalisz, 1988).
منابع توليد کننده پروتئاز
گياهان: گياهان پروتئازهاي متعددي با خواص فيزيکوشيميايي متفاوت توليد مي کنند. از ميان پروتئازهايي که توسط گياهان توليد مي شوند و بيشترين اهميت را در بين آنها دارند، مي توان به پروتئازهاي پاپائين، برومولين و کراتيناز اشاره نمود. مشکل اصلي در توليد پروتئازهاي گياهي احتياج به زمان زياد در روند توليد مي باشد که کاربرد آنها را محدود نموده است.
پاپائين: يک سيستئين پروتئازي است كه از شيره خام ميوه گياه Papayacarica كه درمناطق استوايي ميرويد استخراج مي شود. اين پروتئاز گياهي در محدوده pH بين 5 تا 9 مقاوم است و تا دماي 80 يا 90 در حضور سوبسترا پايدار استو کاربرد وسيع در صنايع غذايي براي تهيه پروتئين هيدروليز شده دارد.
برومولين: نوعي سيستئين پروتئاز مي باشد که از ساقه و آب آناناس تهيه مي شود.(از ريشه و آب آناناس) و در محدوده pH بين 5 تا 9 فعال است و در دماي C°70 غير فعال مي شود.
کراتيناز: پروتئاز گياهي مي باشد که در هضم آنزيمي پشم و مو به منظور توليد اسيد آمينه ضروري ليزين و کمک به سيستم هضم فاضلاب کاربرد دارد.
جانوران:
پروتئازهاي توليد شده توسط سلولهاي حيواني در صنعت کاربردهاي وسيعي دارند. از جمله مهمترين آنزيم هاي کاربردي در صنعت مي توان به مواردي همچون تريپسين، کيموتريپسين، پپسين و رنين اشاره نمود.
Trypsin: تريپسين آنزيم اصلي دستگاه گوارش است که مسئول هيدروليز پروتئين هاي غذا است. نوعي سرين پروتئاز با وزن مولکولي 23 کيلودالتون مي باشد و در کنترل بيولوژيک آفات حشرات، توليد هيدروليزات پروتئيني و در تهيه ي محيط کشت ميکروبي و بعضي کاربردهاي تخصصي پزشکي استفاده مي شود.
Chymotrypsin: آنزيم کيموتريپسيناز پانکراس در روده ترشح مي شود.pH مناسب براي فعاليت آن 8 مي باشد. اين آنزيم تنها پيوندهاي پپتيدي را مورد حمله قرار مي دهد که گروه هاي کربوکسيل در آنها از اسيد آمينه تيروزين يا فنيل آلانين و يا تريپتوفان تامين شده باشد. داراي وزن مولکولي 23 کيلو دالتون مي باشد که استفاده در تشخيص پزشکي دارد.
Pepsin: پپسين پروتئاز اسيدي از نوع آسپارتيل پروتئاز مي باشد. فعاليت بهينه بين pH 1 و 2 است و در pH بالاتر از 6 غير فعال مي شود و وزن مولکولي 34 کيلودالتون دارد.
Renin: آنزيمي با وزن مولکولي 30 کيلودالتون مي باشد که در صنايع لبني به هنگام تهيه ماست و پنير مورد استفاده قرار مي گيرد (Rao et al, 1998).
آنزيم هاي ميکروبي
ميکروارگانيسم هاي توليد کننده پروتئاز، به دلايلي همچون قابليت کشت در سطحي وسيع، توليد آنزيم در مقياس بالا و داشتن نيمه عمري بيشتر نسبت به ساير پروتئازها اهميت خاص دارند. اغلب اين آنزيم ها را مي توان هفته ها بدون تغيير آشکار در فعاليت آنزيمي نگهداري نمود. در ضمن به دليل توليد آنزيم خارج سلولي، بر خلاف پروتئازهاي حيواني و گياهي که باعث سهولت روند مراحل عمليات پايين دستي4 و مراحل خالص سازي آنزيم مي شود، هدف اصلي در مطالعات علمي براي کاربرد در صنعت قرار دارند (Kumar& Takagi, 1999).
باکتري ها
پروتئازهاي باکتريايي يکي از بزرگترين کلاس آنزيم هاي صنعتي مي باشد که در حدود 40% از کل فروش آنزيم ها در سراسر جهان به شمار مي روند. ناتواني پروتئازهاي گياهي و جانوري در از بين بردن مطالبات جهاني استفاده از آنزيم ها، باعث توجه ويژه به پروتئازهاي ميکروبي شده است (Claudia et al 1993) و (Rao et al, 1998). در صنعت منابع گياهي و جانوري براي توليد آنزيم به ترتيب مقادير 8% و4% از كل آنزيمها را شامل مي شوند و ساير آنزيمهاي استفاده شده منشأ ميكروبي دارند (Bronscheuer& Pohl, 2001). منابع ميكروبي به دليل ويژگي هاي زير به منابع گياهي و حيواني ترجيح داده مي شوند.
داراي تنوع بيوشيميايي گسترده اي هستند.
براي توليد ارزان هستند.
داراي قابليت بهتر در دستکاري ژنتيکي براي توليد آنزيم هاي جديد به منظور کاربرد هاي مختلف مي باشند.
مواد مضري كه ممكن است فعاليت آنزيم را كاهش دهد يا تخريب كند در گياهان و جانوران بيشتر است.
ميکروارگانيسم ها داراي رشد سريع و. نياز به فضاي محدود براي کشت سلول مي باشد.
پايداري پروتئين هاي ميكروبي نسبت به همتاهاي گياهي وجانوري خود بيشتراست (Waites et al, 2001) و (Chaplin& Bucke, 1990).
قارچ ها
از ديگر منابع اصلي توليد کننده پروتئازها مي توان قارچ ها را نام برد. قارچ ها نسبت به باکتري ها، پروتئازهاي متنوع تري را توليد مي کنند که در محدوده pH وسيع 4 تا 11 فعال هستند. در ضمن دامنه هضم سوبسترايي وسيع تري نسبت به پروتئازهاي باکتري ها دارند. با وجود تمامي مزيت هاي مذکور، پروتئاز هاي قارچي به دليل فعاليت پايين آنزيم و عدم پايداري در برابر حرارت کمتر از پروتئازهاي باکتريايي در صنعت استفاده مي شوند. در ميان قارچ هاي توليد کننده پروتئاز، آسپرژيلوس ها بالاترين ميزان پروتئاز را توليد مي کنند و از لحاظ تجاري حائز اهميت هستند. از پروتئازهاي قارچي به دليل فعاليت بهينه در pH هاي اسيدي بين 4 تا 5/4 و پايداري و فعاليت در pH بين5/2تا 6، در صنايع غذايي به منظور لخته نمودن شير و تخمير پنير استفاده مي شود.
ويروس ها
ويروس ها پروتئازهاي متعددي را براي پردازش پروتئين هاي کپسيدي و آنزيم هاي پليمرازي توليد مي نمايند. دانشمندان توانسته اند از پروتئازهاي ويروسي عليه پروتئين هاي ويروسي ايجاد کننده بيماري هاي مهلک همچون سرطان و AIDS استفاده نمايند. ويروس ها انواع پروتئازها شامل سرين پروتئازها، آسپارتيک پروتئازها و سيستئين پپتيدازها را توليد مي نمايند ولي تا به حال هيچ متالوپروتئازهاي در بين پروتئازهاي ويروسي مشاهده نشده است (Lu et al, 1969).
1-2-6-2 دسته بندي پروتئازها
راه هاي گوناگوني براي طبقه بندي پروتئاز ها وجود دارد اما به طور کلي پروتئازها را بر اساس سه اصل اساسي زير طبقه بندي مي کنند.
الف) نوع واکنشي که کاتاليز مي نمايند ب) طبيعت شيميايي جايگاه فعال آنزيم ج) ارتباطات تکاملي بر اساس ساختار آنزيم.
در مجموع پروتئازها با توجه به محل اثرشان به دو گروه اگزوپپتيداز و آندوپپتيداز دسته بندي مي شوند و هر کدام را نيز با توجه به جايگاه فعالشان به زيرگروه هايي تقسيم مي نمايند.
اگزوپپتيداز ها
اين گروه از پروتئازها در يکي از دو انتهاي کربوکسيل يا آميني پروتئين عمل مي نمايند و بر همين اساس نيز به دو گروه آمينوپپتيداز و کربوکسي پپتيداز دسته بندي مي شوند.
آمينوپپتيدازها
اين دسته از پروتئازها، اسيدهاي آمينه را به شکل تک تک، دوتايي و يا سه تايي از انتهاي آميني پروتئين آزاد مي سازند. آمينو پپتيدازها توسط گستره وسيعي از ميکروارگانسيم ها شامل باکتري ها و قارچ ها توليد مي شوند. به طور کلي آمينوپپتيدازها، آنزيم هاي داخل سلولي مي باشند و در آسپرژيلوس اوريزه نوع خارج سلولي آن نيز گزارش شده است (Labbe et al, 1974).
کربوکسي پپتيدازها
اين دسته از پروتئازها اسيدهاي آمينه را به صورت تک تک يا دو تايي از انتهاي کربوکسيل پروتئين آزاد مي نمايند و بر اساس جايگاه فعال آنزيمي به سه گروه سرين کربوکسي پپتيداز، متالوکربوکسي پپتيداز و سيستئين کربوکسي پپتيداز تقسيم مي شوند.
اندوپپتيدازها
اين دسته از پروتئازها در جايگاه هاي داخل پلي پپتيد عمل مي نمايند و بر اساس اسيد آمينه موجود در جايگاه فعالشان به چهار دسته تقسيم مي شوند.
1.سرين پروتئازها
2. سيستئين پروتئازها
3. آسپارتيک پروتئازها
4 . متالوپروتئازها
سرين پروتئازها
اين گروه از پروتئازها در تعداد کثيري از ارگانيسم ها از قبيل ويروس ها، باکتري ها و يوکاريوت ها مشاهده شده است و جزء آنزيم هاي حياتي براي ارگانيسم ها مي باشند. سرين پروتئاز به اشکال گوناگون اگزوپپتيداز، اليگوپپتيداز و امگا پپتيدازي در ارگانيسم هاي مختلف مورد بررسي قرار گرفته است. اين آنزيم ها در ناحيه فعال خود يک سرين دارند و عموما” بوسيله DFP(Diisopropyl fluorophosphates) يا Phenylmethylsulphonyl fluoride) PMSF ) مهار مي شوند. به طور کلي به چند گروه اصلي تقسيم مي شوند که شامل کيموتريپس(SA)، سابتيليزين(SB)، کربوکسي پپتيداز C(SC)، D-Ala-D-Ala پپتيدازA در اشرشياکلي (SE) و مهار کنندهLex A (SF) مي باشند (S=Subtilisin). در سه گروه اول يعني SA، SB، SC توالي همسان سه تايي (Triad) شامل اسيد هاي آمينه سرين (نوکلئوفيل)، آسپارتيک اسيد (الکتروفيل) و هيستيدين در جايگاه فعال قرار مي گيرد. نکته ديگر حائز اهميت، حضور مناطق کاملا محافظت شده اسيدآمينه گلايسين (GLY) در کنار توالي همسان سه تايي مي باشد که تشکيل موتيف (GLY-Xaa-Ser-Yaa-Gly) را داده است (Shimogaki et al, 1991).
سرين پروتئازها عموما” در pH خنثي يا قليايي فعال هستند و فعاليت بهينه آنها در pH بين 7 تا 11 مي باشد. آنها داراي اختصاصيت وسيعي در سوبسترا بوده و از آن جمله فعاليت استروليتيک قابل ملاحظه اي در برابر سوبستراهاي استري دارند. وزن مولکولي آنها معمولا” کم (5/18 تا 35 کيلودالتون) است ولي بزرگترين سرين پروتئاز گزارش شده در ميکروارگانيسمها پروتئاز موجود در Blakeslea trispora با وزن مولکولي 126 کيلودالتون بوده است. بيشتر آنها نقطه ايزوالکتريک بين 4/4 تا 2/6 دارند (Kalisz, 1988).
سيستئين پروتئازها
اين دسته از پروتئازها در پروکاريوت ها و يوکاريوت ها توليد مي شوند و فعاليت پروتئوليتيک آنها به جايگاه دوگانه حاوي سيستئين و هيستيدين بستگي دارد. عامل اصلي تمايز در اين دسته آنزيم ها ترتيبcys-his، His-cys مي باشد که باعث تفاوت در عملکرد آنها مي شود (Gupta et al,2002). سيستئين پروتئازها نسبت به محلولهاي سولفيدريل مانند pCMB، TLCK، اسيد ايدواستيک، ايدواستاميد و فلزهاي سنگين حساس بوده و در حضور محلولهاي احياکننده مانند سيانيد پتلسيم يا سيستئين و EDTA فعال مي شوند. بيشتر اين آنزيم ها در pH بين 5 تا 8 فعال بوده و بعضي از آنها بوسيله مواد احياکننده تحريک مي شوند (Kalisz, 1988). پپتيداز گياهي پاپائين شناخته شده ترين سيستئين پروتئاز مي باشد در سيستئين پروتئازها يک مجموعه کاتاليک سه تايي سيستئين-هيستيدين-آسپارتات وجود دارد که در واقع آنالوگ سرين-هيستيدين-آسپارتات در سرين پروتئازها است.
آسپارتيک پروتئازها
بيشتر آسپارتيک پروتئازها به خانواده پپسين تعلق دارند. خانواده ديگري که در اين گروه قرار مي گيرد پروتئازهاي ويروسي مانند رتروپپسين5 (پروتئاز ويروس ايدز) هستند. آسپارتيک پروتئازها براي فعاليت کاتاليک احتياج به گروه آسپارتيک اسيد دارند. مطالعات کريستالوگرافي نشان داده است که اين آنزيم به صورت دو قطعه اي (دو لوبي6) است که سايت فعال بين دو لوب همولوگ قرار مي گيرد. هر لوب يک گروه آسپارتات را ارائه مي دهد. اين دو باقيمانده آسپارتيل در مولکول فعال در فضا کاملا در نزديکي هم قرار دارند و يکي از آنها يونيزه شده در حاليکه ديگري يونيزه نشده است.در اين بين رتروپپسين داراي يک ريشه آسپارتات (مونومريک) است که براي فعال شدن آنزيم بايد ديمريزه شدن صورت گيرد. در کاتاليز با آسپارتيک پروتئازها برخلاف ساير گروه هاي پروتئازها (سرين و سيستئين پروتئازها) شکل گيري واسطه اي با پيوند کووالانسي (آنزيم- سوبسترا) ديده نمي شود و حمله نوکلئوفيلي با انتقال همزمان دو پروتون صورت مي گيرد(Horikoshi, 1999).
آسپارتيک پروتئازها به وسيله فعاليت حداکثر در pH پايين (3 تا 4) و عدم حساسيت به مهارکننده هاي سه گروه ديگر آنزيم ها شناخته مي شوند. بيشتراسپارتيک پروتئازها به ترکيبات اپوکسي کتون و دي آزوکتون در حضور کاتيون هاي مس حساسند. بيشتر اسپارتيک پروتئازها داراي وزن مولکولي بين 30 تا 45 کيلودالتون بوده و نقطه ايزوالکتريک آنها معمولا” بين 4/3 تا 6/4 مي باشد.
متالوپروتئازها
متالوپروتئازها متنوع ترين گروه پروتئازها و شامل آنزيم هايي مانند کلاژناز، هموراژيک توکسين7و ترموليزين باکتريايي هستند تمام متالوپروتئازهاي گزارش شده داراي pH بهينه بين 5 تا 9 بوده و اين آنزيم ها به حضور کاتيون دو ظرفيتي وابسته هستند بنابراين نسبت به محلولهاي Chelat کننده فلز مانند EDTA حساس مي باشند ولي تحت تاثير مهارکننده هاي سرين پروتئازها يا محلول هاي سولفيدريل قرار نمي گيرندو تعدادي از آنزيم هاي مهار شده بوسيله EDTA، در حضور يون هايي مانند روي، کلسيم و کبالت دوباره فعال مي شوند.متالوپروتئازها فراوان بوده ولي فقط در تعداد کمي از قارچ ها گزارش شده اند. بيشتر متالوپروتئاز هاي باکتريايي و قارچي حاوي روي مي باشند که به ازاي هر مولکول آنزيم يک اتم روي گزارش شده است. اتم روي براي فعاليت آنزيم ضروري مي باشد و کلسيم براي پايدار کردن ساختمان پروتئين لازم است. بيشتر متالوپروتئازها داراي موتيف His-Glu-Xaa-Xaa-His



قیمت: تومان


پاسخ دهید