دانشگاه آزاد اسلامي
واحد علوم دارويي
دانشکده علوم و فناوريهاي نوين، گروه زيست شناسي
پايان نامه براي دريافت درجه کارشناسي ارشد (M.Sc.)
گرايش: ميکروبيولوژي
عنوان:
توسعه تست آويديته الايزا با استفاده از پروتئينهاي نوترکيب براي تمايز عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسما
استاد راهنما:
جناب آقاي دكتر مجيد گلکار
استاد مشاور:
سرکار خانم دكتر زرين تاج ولدخاني
نگـارش:
يونس آهنگر انزابي
شمار پايان نامه: 62م سال تحصيلي 93-1392
اين پايان نامه را تقديم مي کنم به
پدر و مادر مهربان و بزرگوارم
که هر آنچه دارم پس از لطف خداوند يکتا از مهرباني ها و فداکاري هاي آن هاست که آن نيز تجلي الطاف خداست.
و نيز تقديم مي کنم به خواهر مهربان و نازنينم
به خاطرهمه همدلي هايش.
تقدير وتشکر:
بيشترين سپاس را از استاد بزرگوار جناب آقاي دکتر گل کار به واسطه حضور پر رنگ و راهنمايي هاي بي دريغ و دلسوزانه ايشان مي دانم که بدون آن، اين پايان نامه راه به جايي نمي برد.
استاد ارجمند آقاي دکتر حسيني دوست را به دليل نظرات سازنده شان سپاس مي گويم.
از همکاران خوبم آقاي بابايي و خانم ها اميري و محبتي که الفباي کار در آزمايشگاه را از ايشان آموختم و دوستان نازنينم آقاي عظيمي و عبدالعلي پور و آقاي دکتر شمس الدين و همچنين آقاي سيروس ومهندس ميلاد و حسام شاکري ومعصومه کولايي و آقاي مهندس مهدي خرازي براي همفکري ها و همدلي هايش سپاسگزارم.
از همه مسئولين و همکاران محترم بخش انگل شناسي، دکتر نداف، خانم ها حسن، عقيقي، دکتر ولد خاني و خير خواهان، به واسطه همکاري هاي صميمانه شان و همه دوستان و عزيزاني که به طريقي در طي اين طريق مرا ياري رساندند کمال تشکر را دارم.
دانشگاه آزاد اسلامي
واحد علوم دارويي
دانشکده علوم و فناوريهاي نوين
پايان نامه براي دريافت درجه کارشناسي ارشد (M.Sc.)
گرايش: ميکروبيولوژي
عنوان:
توسعه تست آويديته الايزا با استفاده از پروتئينهاي نوترکيب براي تمايز عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسما
نگـارش:
يونس آهنگر انزابي
شهريور1393
هيات داوران: 1- دکتر سيد رضا حسيني دوست
2- دکتر احمد رضا اسماعيلي

فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکيده 1
مقدمه 3
فصل اول: کليات
1-1- اتصال ونفوذ توکسوپلاسما گوندي به سلول 12
1-2-راه انتقال 13
1-2-1-مصرف مواد انگل آلوده به اووسيست 14
1-2-2-مصرف گوشت حاوي کيست نسجي 15
1-2-3-انتقال از طريق جفت 15
1-3- همه گير شناسي عفونت توکسوپلاسمايي 16
1-3-1-عوامل موثر در همه گير شناسي توکسوپلاسما گوندي 18
1-3-1-1-عوامل مربوط به انگل 18
1-3-1-2-عوامل مربوط به ميزبان 18
1-3-1-3-عوامل مربوط به محيط 19
1-4-آنتي ژنهاي توكسوپلاسما گوندي 19
1-5-واکسيناسيون 21
1-6-بيماريزايي 22
1-7-توکسوپلاسموزيس مادرزادي 24
1-8-تظاهرات باليني 25
1-9-تشخيص توکسوپلاسموز 29
1-9-1- تشخيص مستقيم 29
1-9-1-1-تشخيص هيستولوژي (بافت شناسي 29
1-9-1-2- جداسازي توکسوپلاسما گوندي 30
1-9-1-3-تکنيک واکنش زنجيري پليمراز (PCR1-15-2-تشخيص غير مستقيم 30
1-9-2-تشخيص غير مستقيم ……………………………………………………………………………………………………… 31
1-9-2-1- تست رنگي سابين – فلدمن 34
1-9-2-2- سنجش آنتي بادي فلوئورسنت غير مستقيم 34
1-9-2-3- تست سنجش آگلوتيناسين ايمنوسوربنت 35
1-10-الايزا (ELISA) 35
1-10-1- الايزاي مستقيم 36
1-10-2- الايزاي غير مستقيم 36
1-10-3- الايزاي ساندويچ 37
1-10-3-1-الايزاي ساندويچ مستقيم 37
1-10-3-2-الايزاي ساندويچ غير مستقيم 37
1-10-4- الايزاي رقابتي يا مهاري 37
1-11-کاربرد پروتئين هاي نوترکيب در تشخيص توکسوپلاسماَ 38
1-12-توليد پروتئين نوترکيب 39
1-13-تشخيص سرولوژي توکسوپلاسموزيس در دوران حاملگي 39
1-14-ارزش تشخيصي ايزوتايپ هاي مختلف ايمونوگلوبولين
اختصاصي توکسوپلاسما در تشخيص عفونت 40
1-15-کاربرد IgGAvidity در افتراق عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسموزيس 42
1-16-درمان 44
1-17-پيشگيري 47
1-18- بيان مسئله و اهميت آن 48
1-19- دلايل انتخاب موضوع 50
1-20-اهداف و فرضيا ت 51
فصل دوم: مروري بر تحقيقات گذشته
2-1- مروري بر تحقيقات گذشته 53
فصل سوم: مواد و روشها
3-1- تخليص پروتئين با روش کروماتوگرافي تمايلي 59
3-1-1-مکانيسم تخليص پروتئين با روش کروماتوگرافي تمايلي 59
3-1-2- تهيه و تخليص پروتئين هاي نو تركيب rGRA7 (pUET-GRA7) و
rGRA6(PUET-GRA6 60
3-2- بررسي و تائيد پروتئين هاي تخليص شده 62
3-2-1- بررسي و تائيد پروتئين هاي نوترکيب GRA7 و GRA6 بوسيله آناليز SDS-PAGE 62
3-2-2- تائيد هويت پروتئين بيان شده با روش وسترن بلات 66
3-3- دياليز نمونه هاي تخليص شده 71
3-4- تعيين غلظت پروتئين 71
3-5- سيستم هاي الايزا(اصول کار) 71
3-5-1- طراحي سيستم هاي الايزا 72
3-5-1-1- نکات تکنيکي در الايزا 72
3-5-1-2- برخي مشکلات در الايزا 74
3-6- بررسي پتانسيل PUET-GRA7 و PUET-GRA6 در تشخيص عفونت حاد و مزمن
توکسوپلاسموز با روش الايزا 76
3-6-1-برقراري شرايط الايزا 76
3-6-2- استفاده از ليزات باکتري در الايزا 76
3-7- اندازه گيري ميزان آنتي بادي به روش الايزاي غير مستقيم 77
3-8-تعيين Cut off در روش الايزا 80
3-9- اندازه گيري ميزان آنتي بادي IgG با کيت تجاري Euroimmun 81
3-10- اندازه گيري ميزان آنتي بادي IgM با کيت تجاري Euroimmun 82
3-11- برقراري شرايط بهينه به منظور محاسبه Avidity Index IgG 82
3-12- اندازه گيري IgG Avidity Index با استفاده از پروتئين هاي نوترکيب PUET-GRA7 و
PUET-GRA6 83
3-13- اندازه گيري IgG Avidity Index با استفاده از کيت تجاري EUROIMMUN 83
3-14- اندازه گيري IgG Avidity Index با استفاده از کيت تجاري Microgen 85
3-15- محاسبه اندکس اويديته نسبي (RAI) Relative avidity Index 88
3-16- کنترل کيفي 88
3-16-1- حساسيت 88
3-17-طراحي تحقيق 88
3-18- تعداد نمونه و روش نمونه گيري 89
3-18-1- تعداد نمونه 89
3-18-2- روش نمونه گيري 89
فصل چهارم: نتايج آزمايشات
4-1 :تهيه و تخليص پروتئين هاي نو تركيب rGRA7 (pUET-GRA7 و rGRA6
(PUET-GRA6 92
4-2- تاييد هويت پروتئين هاي تخليص شده با روش وسترن بلات 93
4-3- بررسيIgG,IgM,IgG Avidity نمونه هاي سرمي با کيت استاندارد Euroimmun 94
4-3-1- نتيجه آزمايشات IgG ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرمهاي
ايراني با کيت Euroimmun… 95
4-3-2- نتيجه آزمايشات IgM ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرمهاي با کيت Euroimmun 95
4-3-3-نتيجه آزمايشات IgG Avidity ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرم ها
با کيت Euroimmun 96
4-4- برقراري شرايط ELISA Avidity با پروتئين هاي نوترکيب 100
4-5- نتايج آزمايش Avidity ELISA با استفاده از پروتئين نوترکيب GRA6 براي تمايز
عفونت حاد ومزمن در سرم هاي زنان باردار 103
4-6- نتايج آزمايش Avidity ELISA با استفاده از پروتئين نوترکيب GRA7 براي تمايز
عفونت حاد ومزمن در سرم هاي زنان باردار ايران 103
4-7- بررسي نتايج ناهمخوان بين الايزا اويديته با پروتئين هاي GRA6 وGRA7 و کيت
Euroimmun با استفاده از کيت Microgen 104
فصل پنجم:بحث، پيشنهادات
منابع 121
خلاصه انگليسي 127
ضمائم 129
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول3-1: جدول ارزيابي اويديتي در کيت ميکروژن 87
جدول 4-1: نتايج آزمايشات Avidity ELISA,IgG,IgM سرم ها با کيت Euroimmon 97
جدول 4-2: بررسي نتايج ناهم خوان با کيت هاي Microgen,Euroimmun و پروتئين هاي
GRA6 وGRA7 106
جدول شماره 4-3: نتايج آزمايش IgG وIgG Avidity با پروتئين هاي GRA6 و GRA7
بر روي سرم هاي زنان باردار ………………………………………………………………………………………………… 108
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل1-1- شكل شماتيك يك تاكي زوايت و يك برادي زوايت توكسوپلاسما گوندي 4
شکل1-2- عكس ميكروسكوپ الكتروني يك تاكي زوايت، سوش VEGكه در حال
نفوذ به يك نوتروفيل صفاق موش مي باشد 7
شکل1-3- عکس ميکروسکوپ الکتروني از تاکي زوايت سوش VEG در حال تقسيم
اندوديوژني داخل ماکروفاژ صفاق موش 8
شکل1-4- يك كيست بافتي توكسوپلاسما كه حاوي بيش از هزار برادي زوايت مي باشد 9
شکل 1-5- راه هاي انتقال انگل توکسوپلاسما گوندي در ميزبان اصلي و حد واسط 16
شکل 1-6- دختري با هيدروانسفالي بعلت توکسوپلاسموز مادرزادي 25
شکل 1-7- شکل شماتيک انواع الايزا………………………………………………………………………………….. 38
شکل3-1:نوارهاي کيت ميکروژن……………………………………………………………………. 87
شکل 4-1 : تخليص پروتئين GRA6 به روش کروماتوگرافي تمايلي 92
شکل 4-2: تخليص پروتئين GRA7 به روش کروماتوگرافي تمايلي 93
شکل 4-3: بررسي هويت آنتي ژنيسته پروتئين هاي GRA6 وGRA7
تخليص شده باروش وسترن بلات 94
شکل 4-4 : تعيين غلظت بهينه اوره براي تفکيک سرمهاي فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما
در آويديته الايزا با استفاده از پروتئين GRA6 101
شکل 4-5 : تعيين زمان بهينه شستشو با محلول اوره به منظور تفکيک سرم هاي فاز حاد از مزمن
عفونت توکسوپلاسما در آويديته الايزا با استفاده از پروتئين GRA6 101
شکل 4-6 : تعيين غلظت بهينه اوره براي تفکيک سرمهاي فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما
در آويديته الايزا با استفاده از پروتئين GRA7 102
شکل 4-7 : تعيين زمان بهينه شستشو با محلول اوره به منظور تفکيک سرم هاي فاز حاد از مزمن
عفونت توکسوپلاسما در آويديته الايزا با استفاده از پروتئين GRA7 102
شکل4-8: مدلي از بلوغ آنتي بادي هاي IgG به آنتي ژن هاي توکسوپلاسماي 105
شکل 4-9: نتايج کيت ميکروژن106
شکل4-10: مقايسه اجراي تست Avidity با کيت Euroimmun و پروتئين GRA6 براي افتراق
عفونت حاد و مزمن و تحت حاد………………………………………………………………………………………………… 107
Abbreviations:
AC- Affinity chromatography
ADCC – Antibody – Dependent Cell – Mediated Cytotoxicity
AIDS – acquired immunodeficiency syndrome
APS – Ammonium persulfate
BAG – bradyzoite antigen
BCA – bicinchoninic acid assay
BSA – bovine serum albumin
CSF – Cerebrospinal fluid
CD – cluster of differentiation
DAB – Diamino benzidine
DNA – Deoxyiribonucleic acid
EDTA – Ethylenediaminetraacetic acid
ELISA – Enzyme-linked immunosorbent assay
EI – Enzyme immunoassay
FPLC – Fast protein liquid chromatography
FSH – Follicle – stimulating hormone
FDA – Food and drug Administration
GRA – granule antigen
GST – glutathione S-transferase
HCG – Human chorionic gonadotropin
HIS-TAG – histidine-tag
IEC – Ion-exchange chromatography
IMAC – immobilized – metal affinity chromatography
IPTG – Isoproyl -B-D-thio-galactoside
Ig – immunoglobulin
IFN- Interferon
IL – interleukin
LH- Luteinnizing hormone
MBP – Maltose Binding Protein
MAG – Matrix antigen
MIC – Microneme
NI-NTA – Nikel nitrilotriacetic acid
OD – Optical density
OPD – o – phenylenediaminedihydrochloride
PBS – Phosphate – bufferedsaline
PSA- Prostate – specific antigen
PV – Parasitophorus vacuole
PFGE – Pulsed Field Gel Electrophoresis
PCR – Polymerase chain reaction
RAI – Relative avidity index
ROP – Rhoptry protein
RNA – Ribonucleid acid
SDS-PAGE – sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SAG – surface antigen
TBS – Tris buffered Saline
TEMED – Tetramethylenediamine
TMB – Tetra Methyl Benzidine
Th – T -helper
TRX – Thioredoxin
TSH – Thriod – Stimulating hormone
TNF – Tumor necrosis factor
چکيده فارسي
توکسوپلاسموزيس که توسط انگل اجباري درون سلولي توکسوپلاسما گوندي، ايجاد مي شود. در افرادي که از سيستم ايمني سالمي برخوردارند، عفونت اوليه معمولاً بدون علائم ويا با عوارض خفيفي همراه است، ولي در نوزاداني که عفونت را به طور مادرزادي دريافت کرده اند، ممکن است منجر به عوارض خطرناکي مثل عقب ماندگي ذهني، کوري و يا حتي مرگ شود. بنابراين تشخيص صحيح عفونت اخير (recent) توكسوپلاسما و تمايز آن از عفونت مزمن در زنان باردار، اهميت حياتي در مراقبتهاي درماني مادر و جلوگيري از بروز عوارض عصبي- مغزي در جنين دارد. از آنجايي که پاسخ آنتي بادي هاي IgM در درصد قابل ملاحظه اي از افراد، ماه ها يا حتي سال ها پس از کسب عفونت، مثبت باقي مي ماند، تمايز صحيح ميان عفونت حاد و مزمن به ويژه در زنان باردار، اهميت فوق العاده اي دارد. در حال حاضر، بنظر مي رسد تركيب دو روش الايزاي IgM و الايزاي آويديته IgG بهترين و مطمئن ترين نتايج را براي تشخيص عفونت حاد و تمايز آن از عفونت مزمن مي دهند. شرايط بهينه روش IgG avidity ELISA براي تمايز سرم ها از عفونت حاد ومزمن با استفاده از دو پروتئين GRA7 وGRA6 برقرار (develop) شد. در نهايت ،كارايي روش avidity ELISA با استفاده از دو پروتئين فوق براي تشخيص عفونت حاد و مزمن در زنان باردار بررسي شد. در اين تحقيق از کيت استاندارد Microgen جهت مقايسه نتايج ناهمخوان مابين کيت Euroimmun و پروتئين هاي نوترکيب GRA6 وGRA7 استفاده شد، نتايج بدست آمده از کيت Microgen دقيقا شبيه با پروتئين هاي نوترکيب بود. دراين تحقيق از 21 سرم حاد و 28 سرم مزمن و 29 سرم تحت حاد زنان مبتلا به توکسوپلاسما كه حاد و مزمن وتحت حاد بودن آن با استفاده از تست هاي استاندارد سرولوژيك براي ما مشخص شده بود استفاده شد . از21 سرم حاد در آويديته الايزا با پروتئين GRA6 ، تنها 1 سرم آويديته بالا داشت و از 28 سرم مزمن ، 2سرم آويديته پايين داشت و از 29 سرم تحت حاد 5 سرم آويديته پايين داشتند. در آزمايش با پروتئين GRA7 از 21 سرم حاد، 1 سرم آويديته بالا داشتند و از 28سرم مزمن همه سرم ها آويديته بالا داشتند و از 29 سرم تحت حاد ، 6 سرم آويديته پايين داشتند.همچنين در اين تحقيق تعدادي از سرم ها که نتايج ناهمخواني ما بين کيت Euroimmun و پروتئين هاي نوترکيب GRA6 و GRA7داشتند را با استفاده از کيت استاندارد Microgen بررسي کرديم که نتايج اين کيت استاندارد شبيه پروتئين هاي نوترکيب GRA6 و GRA7بخصوص پروتئين GRA6 بود که اين يافته ها کارايي بهتر GRA6 را نشان مي دهد. استفاده از آنتي ژنهاي نوترکيب به جاي آنتي ژنهاي توتال انگل در کيت تشخيصي آويديته الايزا ممکن است منجر به افزايش کارايي آنها شده و استانداردسازي کيتها را نيز تسهيل کند.
کلمات کليدي : توکسوپلاسما،گوندي ،آويديته الايزا ، GRA7 ،GRA6

مقدمه
تاريخچه و طبقه بندي
انگل توکسوپلاسما گوندي1، يکي از اعضاي شاخه اپي کمپلکسا، راسته کوکسيديا، انگل اجباري درون سلولي بوده که بيماري توکسوپلاسموزيس را ايجاد مي کند.اين انگل با گسترش جهاني، قادر به تکثير در بسياري از ميزبان هاي مهره دار از جمله انسان است. اين ارگانيسم در سال 1908 توسط نيکول و مانسو2 در يک جونده کوچک به نام کتنوداکتيلوس گوندي3 در انستيتو پاستور تونس و تقريباً به طور همزمان توسط اسپلندور4 در برزيل در يك خرگوش آزمايشگاهي کشف شد. ابتدا تصور مي شد اين ارگانيسم گونه اي از جنس ليشمانيا است ولي يک سال بعد، پس از مطالعات بيشتر آن را به عنوان يک ارگانيسم متفاوت شناختند و نام جنس جديد توکسوپلاسما را براي آن پيشنهاد کردند)1و2(. اگرچه توكسوپلاسما گوندي عوارض متعددي در انسان بوجود مي آورد ولي 15 سال بعد از کشف آن بود كه انگل از اتوپسي چشم يك كودك مبتلا به هيدروسفالي جدا شد)3و4(. شيوع توكسوپلاسموزيس تا قبل از ابداع روش تشخيص سرولوژيكي تست رنگي5 به وسيله سابين و فلدمن6 در 1948 )5(، به طور دقيق مورد ارزيابي قرار نگرفت. فرنکل7 در سال 1970 چرخه زندگي را به طور کامل شناسايي و معرفي کرد )1(. موقعيت تاكسونوميك توكسوپلاسما گوندي بر اساس خصوصيات شكل شناسي و چرخه انگلي آن به وسيله ملهورن8 در سال 1988 به صورت زير تعريف شده است.
Kingdom: Protozoa
Phylum: Apicomplexa
Class: Sporozoea
Sub-class: Coccidia
Super- order: Eucoccidea
Order: Eucoccidida
Sub- order: Eimeriina
Family: Eimeriidae
Genus: Toxoplasma
Species: gondii
مورفولوژي و ساختار انگل
توکسوپلاسما از دو کلمه توکسون به معناي کمان يا قوس و پلاسما به معناي سلول مشتق شده است، زيرا ارگانيسم شکل هلالي يا قوسي دارد. انگل داراي سه شکل در چرخه زندگي مي باشد:
1-تاکي زوايت 2-برادي زوايت 3-اسپوروزوايت
هر سه شکل انگل مي توانند ميزبان نهايي و واسطه را آلوده سازند )7(. ولي نقش بيولوژيک اين سه شکل متفاوت است.
شکل 1-1- شكل شماتيك يك تا كي زوايت (چپ) و يك برادي زوايت (راست) توكسوپلاسما گوندي )8(
تاکي زوايت (اندوديوزوايت)
تاکي زوايت شکل آزاد انگل و مربوط به مرحله تكثير سريع آن است که قوسي شکل، به طول 4-8 وعرض2-4 ميکرومتر مي باشد. در عکس هاي حاصل از ميکروسکوپ الکتروني سيستم پيچيده اي از اندامک ها شامل غشاء نازک پوشش خارجي9، حلقه قطبي10، يک مخروط تقريباً تو خالي و بدون رأس به نام کونوئيد11 در انتهاي نوک تيز (قدامي)، روپتري ها12، ميكرونم ها13، ميتوكندري ها14، ميكروتوبول هاي زير غشايي15، رتيكولوم آندوپلاسمي صاف و خشن16، دستگاه گلژي17، ريبوزومها18، يك ارگانل شبيه پلاستيد به نام آپيكوپلاست19 و ميكروپور20 و هسته كاملاً مشخص را مشاهده کرد. )4( (شکل1-1). معمولاً هسته در جهت انتهاي خلفي يا در ناحيه مركزي سلول قرار گرفته است. كروماتين به طور انبوه در تمامي هسته پخش شده و معمولاً هستک21 در مركز هسته جا دارد. کروموزوم ها طي ميتوز متراکم نمي شوند، بنابراين، تعداد کروموزوم ها که 11 عدد مي باشد ، اولين بار با استفاده از PFGE22 شناسايي شده است )9(. در مقاطع هيستولوژي تاکي زوايت ها اغلب تخم مرغي شکل مي باشند )1(. تاکي زوايت ها به شرايط محيطي خيلي حساسند و معمولاً در خارج بدن ميزبان سريعاً از بين مي روند )6(. تاكي زوايت با هجوم فعالانه به غشاء سلول ميزبان و يا به وسيله فاگوسيتوز وارد سلول ميزبان مي گردد. ابتدا انتهاي كونوئيد نفوذ نموده ، كونوئيد به طرف جلو فرورفته و غشاء روپتري با غشاء واحد در انتهاي خلفي توكسوپلاسما گوندي در آميخته، و سوراخي را تشكيل داده كه از طريق آن ترشحات روپتري آزاد مي گردد. احتمالاً محتويات روپتري ها غشاي پلاسمائي سلول ميزبان را در اطراف انتهاي قدامي توكسو پلاسما گوندي حل مي نمايد. زماني كه توكسوپلاسما گوندي وارد سلول ميزبان مي شود، غشاي پلاسمائي پاره شده و گروهي از حفرات ريز يا وزيكول ها (احتمالاً ترشحات روپتري) در نواحي مجاور سيتوپلاسم ديده مي شود. غشاء سلول ميزبان تنها در انتهاي قدامي توكسوپلاسما گوندي پاره مي شود. در طي 15 ثانيه انگل در ماكروفاژ ديده شده، و دخول آن به وسيله فاگوسيتوز 120 ثانيه به طول مي انجامد. به فاصله كوتاهي پس از نفوذ ، توكسوپلاسما گوندي به وسيله حفره يا واكوئل حامل انگل23 (PV) از سلول ميزبان مجزا مي شود. به نظر مي رسد PV به طور دو جانبه از انگل و ميزبان مشتق شده باشد )8(. تاكي زوايت به طريق غير جنسي به وسيله آندوديوژني24 مكرر در درون سلول ميزبان تكثيرمي يابد (شكل1-3). آندوديوژني شكل اختصاصي تقسيم بوده كه در خلال آن دو سلول دختر تشكيل شده و سلول مادري تحليل مي رود. تقسيم تاكي زوايت ها به طريق آندوديوژني تا پر شدن سلول ميزبان از انگل ها ادامه مي يابد. سلول هاي ميزبان كه حاوي تاكي زوايت هاي متعدد هستند، كلون ها، كلني هاي نهايي يا پزودوسيست25 (کيست کاذب) ناميده مي شوند. ندرتاً انگل هاي يك گروه به طور همزمان تقسيم شده، به طوري كه معمولاًسلول هاي پروژني به طور تصادفي يا بي قاعده مرتب مي شوند. با اين وجود، گاهي ممكن است تقسيم همزمان پروژني انجام شده و توده رُز مانند تشكيل گردد. گروهي از تاكي زوايت هايي كه به وسيله يك PV احاطه شده، كلون ناميده مي شوند ) 8و4( . تاکي زوايت هاي توکسوپلاسما فاقد اندامهاي حرکتي مانند تاژک ، مژه يا پاي کاذب بوده و حرکت ارگانيسم با تا شدن بدن يا لغزيدن تواءم با چرخش در حول محور طولي بدن ، انقباض يا موج دار شدن انجام مي گيرد(8و10). در مراحل اوليه عفونت توکسوپلاسمايي يا مرحله حاد بيماري ممکن است گروههايي از تاکي زوايت هاي در حال تکثير در سيتوپلاسم سلولهاي انواع بافتها مشاهده گردند که به مجموعه تاکي زوايت هاي داخل سلول ميزبان کيست کاذب يا کلني نهايي يا تجمعات انتهايي26 اطلاق مي شود(8و10).اين کلني هاي تاکي زوايتي را مي توان بر اساس تفاوت در رنگ پذيري از ارگانيسم هاي موجود در کيستهاي حقيقي توکسوپلاسما متمايز نمود. شکل تاکي زوايت انگل در مرحله حاد عفونت ديده مي شود و مي تواند تمام سلولهاي نسوج پستانداران را مورد حمله قرار دهد . پس از حمله ، انگل هر 4 تا 6 ساعت يک بار تکثير مي يابد و تجمعات شبيه به به آرايش گل تشکيل مي دهد و سر انجام در هر سلول آلوده 16-8 و در مواردي تعداد بيشتري تاکي زوايت تجمع مي يابد. سر انجام سلول با تعداد 64 تا 124 انگل پر شده و سپس سيتوپلاسم انباشته از تاکي زوايت سلول پاره مي شود و ارگانيسم هاي آزاد شده به سلولهاي مجاور حمله مي کنند و در آنها به شيوه اندوديوژني تکثير مي يابند(11).همچنين تاکي زوايت هاي آزاد شده از طريق جريان خون به بافت هاي متعددي از جمله سيستم اعصاب مرکزي ، چشم ،عضلات اسکلتي و قلبي راه يافته و سلولهاي بافتي را آلوده مي کنند. تکثير انگل باعث ايجاد يک پاسخ التهابي شديد و تخريب بافت شده و بنابر اين منجر به تظاهرات باليني بيماري مي گردد(11).
شکل 1-2- عكس ميكروسكوپ الكتروني يك تاكي زوايت، سوش VEGكه در حال نفوذ به يك نوتروفيل صفاق موش مي
باشد )8(.
شکل 1-3- عکس ميکروسکوپ الکتروني از تاکي زوايت سوش VEG در حال تقسيم اندوديوژني داخل ماکروفاژ صفاق موش .
برادي زوايت (سيستي زوايت)
ماحصل سيکل غير جنسي انگل در ميزبان است که انگل در نسوج ميزبان به صورت کيستي در مي آيد. اندازه آن بين 120-20 ميکرومتر متغير است )1(. کيست نسجي در واقع مرحله در حال استراحت27 انگل در بدن ميزبان است اين کيست ها در حقيقت مجموعه اي از برادي زوايت ها ي انگلي هستند که داراي جدار کيستي نازک مي باشند(برادي در زبان يوناني به معناي کند و آرام ). برادي زوايت نيز توسط تقسيم دوتايي آندوديوژني تکثير مي شود که بر خلاف تاکي زوايت به کندي صورت مي گيرد )12(. تاکي زوايت تحت تأثير فشار پاسخ ايمني به برادي زوايت تبديل مي شود و تشکيل کيست مي دهد. کيست هاي بافتي حاوي صدها و هزاران برادي زوايت مي باشند. برادي زوايت هاي داخل کيست ها مادام العمر در ميزبان باقي مي مانند )11(. از نظر ساختاري برادي زوايت و تاکي زوايت اندکي متفاوت هستند . در برادي زوايت ها هسته در جهت انتهاي خلفي قرار دارد. برادي زوايت باريک تر از تاکي زوايت بوده و در محتواي بالاي ميکرونم ها و گرانول هاي آميلوپکتين (منبع انرژي) با تاکي زوايت متفاوت است )8و12(. دانه هاي ليپيدي در برادي زوايت ديده نمي شوند ولي گاهاً در تاکي زوايت ديده مي شوند. در حضور آنزيم هاي پروتئوليتيک، برادي زوايت ها 1-2 ساعت پايدار مي مانند ولي تاکي زوايت ها در مدت 10 دقيقه از بين مي روند. در گربه که ميزبان نهايي است، دوره کمون عفونت زايي (فاصله بين عفونت اوليه تا دفع اووسيست ها) براي برادي زوايت کوتاهتر از تاکي زوايت است )12(. علاوه بر سرعت همانند سازي، برادي زوايت ها وتاکي زوايت ها در بيان ژن و متابوليسم نيز متفاوت هستند. بيان بعضي ژن ها اختصاصي مرحله تاکي زوايت يا برادي زوايت مي باشد. همچنين متابوليسم در برادي زوايت کندتر است.
شکل 1-4- يك كيست بافتي توكسوپلاسما كه حاوي بيش از هزار برادي زوايت مي باشد)8(.
اسپوروزوايت
از نظر شكل شناسي بسيار نزديك به تاكي زوايت مي باشد. در بررسي ميكروسكوپ الكتروني نيز بسيار مشابه تاكي زوايت است، جز اينكه ميكرونم ها و روپتري فراواني در اسپور زوايت وجود دارد. روپتري ها يا متراكم هستند (در برادي زوايت) يا پراكنده هستند (در تاكي زوايت). اسپوروزوايت همانند برادي زوايت، تعداد بسيار زيادي گرانول هاي متراكم دارد. اسپوروزوايت شكلي از انگل است كه مسئول تكثير جنسي توكسوپلاسما گوندي در گربه (ميزبان نهايي) مي باشد و اووسيت ها را به وجود مي آورد كه قطر 10 تا 12 ميكرومتر دارند و شكل مقاوم انگل به محيط بيروني هستند و در مدفوع گربه دفع مي شوند. اسپورولاسيون يك اووسيت توليد دو اسپوروسيت مي كند كه هر كدام حاوي دو اسپوروزوايت هستند )14(.
تغيير اشكال مختلف توكسوپلاسما به يكديگر و نقش آن در بيماري زايي توكسوپلاسما
مشخصه عفونت اوليه و بيماري حاد، حضور تاكي زوايت هاي سريع تكثير شونده مي باشد. حدود 10 تا 14 روز بعد از عفونت، تاكي زوايت ها به برادي زوايت ها تمايز مي يابند كه خيلي آهسته تر تكثير مي شوند و در سراسر بدن تشكيل كيست مي دهند. كيست هاي بافتي مدت زيادي باقي مي مانند و باعث بيماري نمي شوند. در افراد مبتلا به نقص سيستم ايمني مثل AIDS و بدخيمي ها، پاره شدن كيست هاي بافتي و تغيير شكل برادي زوايت به تاكي زوايت منجر به فعال شدن مجدد بيماري مي شود. افراد مبتلا شده از طريق انتقال مادر به نوزاد نيز در معرض خطر فعال شدن مجدد بيماري هستند كه مي تواند چندين بار تكرار شود و بيشتر مغز و چشم هاي آنها را مبتلا مي كند )2(. تغيير شكل تاكي زوايت ها به برادي زوايت ها و بالعكس، نه تنها نقش حياتي در ايجاد عفونت مزمن دارد بلكه مسئول فعال شدن مجدد بيماري نيز مي باشد. فهم اين فرايند مي تواند همچنين در طراحي داروهاي شيميايي جديد كه قادر به از بين بردن كيست هاي بافتي باشند، كمك كند. همچنين شناسايي مولكول هاي سطحي اختصاصي هر مرحله (تاكي زوايت يا برادي زوايت) مي تواند منجر به يافتن واكسن هاي مؤثر يا پيشنهاد راه هايي براي جلوگيري از تهاجم انگل منجر شود )8و14(.
1-1- اتصال و نفوذ توكسوپلاسما گوندي به سلول
به طور كلي، اتصال و نفوذ به سلول هاي ميزبان توسط اشكال مختلف انگل توكسوپلاسما گوندي (تاكي زوايت، برادي زوايت و اسپور زوايت) شبيه به ديگر انگل هاي كوكسيدي بوده و شامل مراحل زير است: 1- حركت كردن انگل 2- شناسايي كردن سلول ميزبان با سركونوئيدال 3- دندانه دار كردن و ايجاد بريدگي در غشاء پلاسمايي سلول ميزبان 4- تشكيل يك محل اتصال متحرك كه هنگامي كه انگل داخل سلول ميزبان نفوذ مي كند پشت سر انگل حركت مي كند 5- ترشح جزئي ميكرونم ها، روپتري ها و گرانول هاي متراكم [8]. زوايت هاي (اشكال مختلف توكسوپلاسما) توكسوپلاسما گوندي مي توانند به سلول هاي مختلفي از ميزبانان بسيار متفاوتي نفوذ كنند. وقتي اين انگل در آزمايشگاه کشت مي شود، تقريباً قادر است که تمام سلول هاي پستانداران، حشرات و ماهي ها را مورد تهاجم قرار دهد، كه نشان مي دهد احتمالاً توکسوپلاسما قادر به بيان چندين نوع متفاوت رسپتور براي ليگاندهاي مختلف مي باشد يا اينکه تعداد کمي از رسپتورها که قادرند به ليگاندهاي مشترک از دودمان هاي سلولي متفاوت متصل شوند. براي شناسايي هر يک از اين دو فرضيه کارهاي زيادي انجام شده و توصيف هاي زيادي انجام شده است و تا به امروز متوجه شده اند که گيرنده هاي سلول ميزبان از جمله لامينين و لكتين و رسپتور سطحي توکسوپلاسما به نامSAG1 در اتصال و نفوذ توكسوپلاسما گوندي دخيل هستند [8، 10]. در واقع در اغلب موارد، غشاء داراي يک خانواده از پروتئين ها است که وابسته به آنتي ژن سطحي SAG1مي باشند.SAG1 مهمترين اين پروتئين ها مي باشد و حداقل در قسمتي از اتفاقات اوليه در اتصال به غشاء ميزبان بکار مي رود. به طور واضحي اين پروتئين تنها مولکول انگل که در اتصال به سلول ميزبان دخيل باشد نيست به طوري که موتانت هايSag- هنوز قادر به عفونت هستند. اگر چه با مشخصات و صفات متفاوت، اين موتانت ها راحت متصل نمي شوند اما به طور ميانگين قادرند در مدت زمان بيشتري وارد سلول ميزبان شوند. اين مدت زمان ورود به داخل سلول هاي ميزبان در اين موتانت ها دو برابر تيپ هاي وحشي مي باشد [36]. زوايت هاي توكسوپلاسما مي توانند همچنين به وسيله راه هايي غير از نفوذ با واسطه رسپتور، وارد سلول هاي ميزبان شوند. اسپير28 و همكاران دريافتند كه بعد از گذر كامل از غشاء سلولي، بعضي از زوايت هاي توكسوپلاسما گوندي پوششي از غشاء سلولي و سيتوپلاسم ميزبان را همراه دارند ولي هنوز قادر به نفوذ به سلولهاي ديگر هستند. زوايت هاي توكسوپلاسما همچنين مي توانند توسط سلول ميزبان اندوستيوز شوند و از اين مسير وارد سلول شوند [10].
اخيراً تحقيقات زيادي روي چگونگي تشكيل واكوئل پارازيتوفوروس (PV) انجام شده است. هنگامي كه تاكي زوايت ها به سلول هاي ميزبان نفوذ مي كنند به وسيله غشايي كه واضحاً از پلاسمالما (ولي عاري از پروتئين هاي ميزبان) است احاطه مي شوند. اين غشاء بعداً تبديل به غشاءPVM29)) مي شود و تعدادي از پروتئين هاي انگل از جمله ROP2، ROP3، ROP4 و ROP7 به آن متصل مي شوند ROP2 در قسمتي از PVM قرار مي گيرد كه منشأ آن از سيتوپلاسم سلول ميزبان است كه اين احتمالاً نشانگر اين است كهROP2 در ارتباطات بيوشيميايي ميزبان و انگل نقش دارد [10]. ظرف چند دقيقه بعد از نفوذ،تاكي زوايت ها PV تازه تشكيل داده، PVM را با پروتئين هاي انگل تغيير مي دهند و يك شبكه غشايي توبولووزيكولار داخل PV شكل ميدهند. PVM احتياج به ساختارهاي منفذ مانندي دارد كه به راحتي مولكول هاي باردار تا اندازهkDa 1200 بتوانند بين PV و سيتوپلاسم سلول ميزبان حركت كنند. پروتئين هاي گرانول هاي متراكم (GRA)30 بعد از نفوذ تاكي زوايت، به داخل PV ترشح مي شوند. GRA3 و GRA5 روي PVM قرار مي گيرند و GRA6،GRA4 و GRA2 و GRA1 به 31TMN مي پيوندند. در جمع اين تغييرات يك محيط مناسب براي انگل در سيتوپلاسم سلول ميزبان فراهم مي كنند كه به كار تكثير انگل مي آيد [10].
1-2-راه انتقال :
توکسوپلاسما گوندي يک انگل تک ياخته اي است که بيش از يک سوم جمعيت جهان به آن آلوده مي باشند. عفونت عمدتا” از طريق غذا وآب الوده با اووسيست هاي دفع شده بوسيله گربه ها يا از طريق خوردن گوشت خام يا نيم پخته حاوي کيست هاي بافتي ايجاد مي گردد (7و11). اما بطور کلي منبع مهم انتقال عفونت در طبيعت گربه ها و گربه سانان مي باشند. گربه هاي آلوده اووسيست هاي انگل را از طريق مدفوع دفع مي کنند که در خارج از بدن انسان در شرايط مناسب محيطي طي يک تا پنج روز هاگ دار و آلوده کننده مي شوند و از طريق مدفوع گربه هاي آلوده ادامه مي يابد که مدت زمان دفع اووسيست طي يک تا سه هفته و ندرتا” تکرار مي شود .علي رغم اينکه تعداد گربه هاي دفع کننده اووسيست در هر زمان زياد نبوده و معمولا” در اکثر کشورها بيش از 2 % نيست ، اما يک گربه آلوده ممکن است روزانه ميليونها اووسيست دفع نمايد .ميزان شيوع توکسوپلاسما گوندي در گربه ها به قابليت دسترسي آنها به پرندگان و پستانداران کوچک که خود از طريق بلع اووسيست آلوده مي شوند



قیمت: تومان


پاسخ دهید